采用mRNA差异显示技术分离东亚飞蝗幼虫抗药性相关基因的研究

摘要

东亚飞蝗是我国重要农业害虫之一，对农业生产危害极其严重。我国目前控制蝗虫的手段主要是采用化学药剂防治为主，由于大量使用化学农药，东亚飞蝗对常用的杀虫剂产生抗药性的问题已经引起了有关植保部门的注意，因此，对其抗药性系统的研究具有非常重要的理论意义和实际应用价值。 本文采用mRNA差异显示PCR技术，对比了东亚飞蝗幼虫在受到氯氰菊酯杀虫剂的诱导后，基因表达发生的变化。通过对差异片段的回收，克隆测Northern点杂交验证，最终确定了4个诱导后差异表达的真阳性cDNA片段，其长度为260-400bp不等。经GenBank同源性分析发现，这4个片段的氨基酸翻译序列分别与不同物种的不同氨基酸序列有较高的同源性。YA21-260翻译的氨基酸序列与土壤微生物(Solibacter usitatus Ellin6076)的抗吖啶黄蛋白(Acriflavin：resistapce protein)有29％的同源性(E值为5.5)；YA22-280翻译的氨基酸序列与硕大利什曼原虫(Leishmania major)保守假设性蛋白(1aypothetical protein conserved)有29％的同源性(E值为6.9)；YG21-280翻译的氨基酸序列与鼠疟疾寄生虫(Plasmodium yoelii yoelii)的DNA聚合酶epsilon催化亚单位(DNA polymerase epsilon catalytic subunit)有32％的同源性(E值9.2)，YG23-400翻译的氨基酸序列与象甲虫(Curculio glandium)的核糖体蛋白$29(ribosomal protein $29)有94％的同源性(E值为3e-26)。 这些基因都直接或间接地参与了东亚飞蝗幼虫抗性调节的生理过程。其中有些基因是近年来刚刚被发现并起步研究的，其结构特征和作用机理还不明确。本文分离出的差异显示片段为东亚飞蝗对常用的杀虫剂产生抗药性的系统的研究提供了参考数据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第一节东亚飞蝗概述

1.1.1我国东亚飞蝗的亚种及地理分布

1.1.2东亚飞蝗的生物学特性

1.1.3东亚飞蝗生育条件分析

1.1.4中国东亚飞蝗发生区的生态类型

1.1.5东亚飞蝗抗药性研究的意义

第二节菊酯类杀虫剂的毒理作用

1.2.1菊酯类杀虫剂的发展及基本特点

1.2.2菊酯类杀虫剂的毒理作用

1.2.3氯氰菊酯杀虫剂的基本特点

第三节昆虫抗药性研究概述

1.3.1昆虫抗药性的定义及监测方法

1.3.2昆虫抗药性机理的研究

第四节本实验的研究意义和特色

第二章材料与方法

第一节实验材料及试剂

2.1.1实验材料

2.1.2主要实验试剂

第二节实验方法

2.2.1东亚飞蝗幼虫的诱导

2.2.2东亚飞蝗幼虫总RNA的提取

2.2.3 RNA纯度和质量鉴定

2.2.4 RNA反转录得到单链cDNA

2.2.5差异显示PCR

2.2.6差异显示片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

2.2.7 PAGE电泳差异显示片段的回收

2.2.8回收片段的二次PCR反应

2.2.9回收片段的克隆

2.2.10测序

2.2.11差异显示片段序列分析

2.2.12 Northern点杂交验证

第三章结果与分析

第一节东亚飞蝗幼虫总RNA的质量鉴定

3.1.1东亚飞蝗幼虫总RNA的纯度检测

3.1.2东亚飞蝗幼虫总RNA的完整性鉴定

第二节东亚飞蝗幼虫单链cDNA的合成

第三节东亚飞蝗幼虫差异显示PCR

第四节测序结果

第五节同源性分析

3.5.1 YA21-260片段的同源性分析

3.5.2 YA22-260片段的同源性分析

3.5.3 YG21-280片段的同源性分析

3.5.4 YG23-400片段的同源性分析

第六节斑点杂交

3.6.1 DNA标记效率检测

3.6.2 Northern点杂交

第七节小结

3.7.1按诱导后基因表达的变化分类

3.7.2按各类基因在东亚飞蝗抗性中可能发挥的功能分类

第四章讨论

第一节直接发挥抗性作用的基因

4.1.1核糖体蛋白S29

4.1.2抗吖啶黄蛋白

第二节间接发挥抗性作用的基因

4.2.1 DNA聚合酶epsilon催化亚单位

4.2.2保守假设性蛋白

第三节其它功能不详的基因

致谢

参考文献

附录

个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果