铜绿假单胞菌运动能力相关新基因的筛选和功能研究

摘要

铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌，在临床上常常引起难治性和顽固性感染。众多毒力因子的产生和存在是铜绿假单胞菌具有感染性和致病性的重要因素，而易形成生物被膜的能力是其耐药性的一个重要原因。菌毛和鞭毛是铜绿假单胞的运动器官和重要的毒力因子，由其介导运动能力在生物被膜形成的早期和维持生物被膜正常的结构中起着重要的作用。本文从研究参与铜绿假单胞菌运动能力的相关新基因入手，采用遗传互补、同源重组和启动子融合报告基因的方法探索与运动相关新基因的功能，为揭示菌体运动机理、预防和抑制生物被膜的早期形成提供实验依据，为药物设计提供新的靶位点。 本文中以一株临床分离株P.aeruginosa PA68为出发菌株，利用Mu转座重组技术构建了突变子文库并从中筛选运动能力发生改变的突变子。在2000多个突变子中筛选得到9株蹭动能力丧失的突变株、9株泳动能力减弱的突变株和1株泳动及蜂群运动能力同时减弱的突变株。通过基因克隆和DNA测序，确定Mu转座子在基因组中的插入位置。结果显示在19株突变株中，Mu转座子共插入到18个不同的基因内部，其中4个是功能未知的新基因(PA2950、PA5001、PA5017和PA5022)。分子杂交的结果证实了Mu转座子DNA单拷贝插入。透射电镜下观察，4个突变株中均有鞭毛的存在；在相差显微镜下观察，4个突变株都有正常的细胞形态和运动能力，由此推测这4个新基因的功能可能不是参与鞭毛合成和结构，而是参与鞭毛运动能力的调控。这是在国际上首次报道这4个新基因参与调控鞭毛的运动能力。 针对上述发现的4个新基因，选择PA5017、PA5022和PA5001三个基因为本文的研究重点，探索它们参与鞭毛运动的可能机制。 PA5017突变株是一株泳动和蜂群运动能力均减弱的菌株。进一步研究发现，该菌株的化学趋向性也减弱，并且形成厚度增加、蘑菇状的生物被膜结构。因此推测，PA5017可能是一个参与化学趋向性、鞭毛运动和生物被膜形成的新基因。遗传互补实验的结果表明外源PA5017基因的表达可以使PA5017突变株的表型恢复到野生型水平。在模式菌株。PAK中，利用同源重组的方法，得到PA5017基因敲除的缺陷株PAK△PA5017(PA5017：：Gm)，并对缺陷株表型进行检测，缺陷株的表型同Mu插入失活的PA5017突变株的表型一致。由此证明PA5017基因参与了调控运动能力和生物被膜的功能。根据结构域和同源性分析，推测PA5017可能是一种信号蛋白。利用启动子融合报告基因的方法来研究PA5017与调控菌体运动能力的化学趋向性系统之间可能的关系。数据分析发现，在PA5017突变株中，操纵子cheYZAB的表达增加约一倍。根据以上的实验结果，本文首次提出PA5017基因可能通过对化学趋向性操纵子cheYZAB的负调节来调控菌体的运动能力，从而影响生物被膜的形成。PA5022突变株是一株泳动能力减弱和生物被膜形成增加的菌株。遗传互补未能使PA5022突变株的表型恢复。用Taq DNA聚合酶单酶RT-PCR的方法初步排除了转座子DNA插入可能引起的极性效应。同源重组的结果排除了可能存在的菌株特异性影响。分析突变株表型不能互补的原因可能是由于PA5022未能正确折叠或定位等原因。据文献报道，PA5022基因失活的突变株毒力减弱，推测PA5022基因可能是一个毒力因子的调控蛋白。群体感应系统是一个重要的毒力因子调控系统，同时，还参与生物被膜形成的调控。文中首次将PA5022基因的功能与群体感应系统联系在一起，选择了6个群体感应相关基因lasl、rhlI、rpoN、rpoS、qscR和vqsR的启动子区融合质粒，分别转化入野生株PA68和PA5022突变株中。根据报告基因表达的差异，推测PA5022可能通过正向调节VqsR因子来实现对群体感应系统的调控，进而影响菌株的毒力。 PA5001突变株是本文中发现的另一株泳动能力减弱和生物被膜形成增加的突变株。遗传互补和同源重组的结果证实了PA5001基因参与鞭毛泳动能力和生物被膜形成的功能。根据结构域和同源性分析，推测PA5001基因可能编码糖基转移酶，可能通过参与能量代谢来参与调控鞭毛的泳动能力。 通过对运动相关新基因的不断研究，可以为进一步阐述菌体的运动机理，理解生物被膜的形成机制，为预防和治疗铜绿假单胞菌引起的感染提供实验依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1铜绿假单胞菌的生物学特性

1.2铜绿假单胞菌的毒力因子

1.3铜绿假单胞菌的运动器官

1.3.1菌毛

1.3.2鞭毛

1.4铜绿假单胞菌的运动能力

1.5铜绿假单胞菌的化学趋向性系统

1.6生物被膜

1.6.1生物被膜的概念

1.6.2细菌生物被膜的形成过程

1.6.3细菌生物被膜的特性

1.6.4细菌生物被膜的耐药机制

1.7群体感应系统(quorum sensing system)

1.7.1群体感应系统的概念

1.7.2铜绿假单胞菌的群体感应系统

1.7.3铜绿假单胞菌群体感应系统的调控网络

1.7.4群体感应系统对生物被膜的调控

1.8本文的研究意义、目的及实验路线

1.8.1研究意义

1.8.2研究目的

1.8.3实验路线

第二章铜绿假单胞菌运动能力相关基因的筛选和鉴定

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.2结果

2.2.1铜绿假单胞菌PA68血清型的鉴定

2.2.2运动能力缺陷突变子的筛选

2.2.3人工Mu转座子插入位点侧翼基因的克隆

2.2.4 Mu转座子DNA插入位点的遗传位置定位

2.2.5 Mu转座子DNA单点插入的确认

2.2.6显微镜观察

2.3讨论

2.4小结

第三章铜绿假单胞菌运动能力相关新基因功能的研究

3.1.PA5017基因功能的研究

3.1.1材料与方法

3.1.2结果

3.1.3讨论

3.2 PA5022基因功能的研究

3.2.1材料与方法

3.2.2结果

3.2.3讨论

3.3PA5001基因功能的研究

3.3.1材料与方法

3.3.2结果

3.3.3 讨论

3.4小结

第四章结论

致谢

在学期间发表的论文

附录

参考文献