蛋白质分子印迹聚合物选择性识别机制及蛋白质复性研究

摘要

蛋白质分子印迹技术有着良好的应用前景，近年来已成为研究热点之一。本文考察了不同类型的洗脱液对本体聚合方法制备的牛血清白蛋白(BSA)印迹聚合物模板分子的洗脱率、再结合率的影响，结果表明去除模板分子BSA的洗脱液的变性作用越强，模板分子的洗脱率越高，而再结合率表现为一定程度的下降；同时考察了BSA分子印迹聚合物选择性识别模板分子的能力，结果表明BSA分子印迹聚合物能够特异性的吸附BSA分子。结论认为蛋白质模板分子在聚合物中留下的印迹“孔穴”形状是蛋白质分子印迹聚合物识别的基础。 蛋白质复性技术的应用能够有效的弥补目前蛋白质分子印迹技术存在的缺陷，解决蛋白质模板分子重复利用的问题。采用体积排阻和反相色谱对SDS、盐酸胍、脲完全变性的蛋白质进行了复性研究，结果表明：反相色谱复性效果明显优于体积排阻色谱；在体积排阻色谱流动相中添加辅助折叠成分能够提高复性回收率；还原变性的蛋白质在非氧化还原体系复性液中能够获得较好的复性效果；SDS是三种变性剂中对蛋白质复性影响最为复杂的，SDS变性的蛋白质的复性既要受到SDS浓度的影响又要受到蛋白质自身的理化性质的制约；复性蛋白质的关键在于去除与蛋白质结合的变性剂和保证蛋白质有充足的折叠时间来进行复性。

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第一章绪论

第一节蛋白质分子印迹技术的概述

第二节蛋白质分子印迹聚合物的制备方法

1.2.1本体聚合法

1.2.2表面印迹聚合法

1.2.3亲和印迹法

1.2.4抗原决定基法

第三节蛋白质印迹聚合物选择性识别机制

第四节蛋白质印迹聚合物选择性识别的影响因素

1.4.1单体类型的影响

1.4.2洗脱条件的影响

第五节变性蛋白质的复性

1.5.1蛋白质复性理论

1.5.2蛋白质复性方法

1.5.3色谱复性影响因素

1.5.4蛋白质复性的检测方法

第二章材料和方法

第一节实验材料

2.1.1材料

2.1.2主要仪器设备

第二节试剂的配制

2.2.1蛋白质分子印迹聚合物洗脱液的配制

2.2.2 Lys活性测定缓冲溶液的配制

2.2.3 Nature-PAGE主要试剂的配制

2.2.4体积排阻色谱柱流动相的配制

2.2.5反相色谱流动相的配制

2.2.6变性液的制备

2.2.7蛋白质液的制备

第三节实验方法

2.3.1 BSA印迹聚合物制备

2.3.2 BSA分子印迹聚合物中的蛋白质模板分子的洗脱

2.3.3洗脱液对BSA分子印迹聚合物的吸附效率的影响

2.3.4 BSA分子印迹聚合选择性的考察

2.3.5蛋白质印迹聚合物洗脱液中蛋白质含量的测定方法

2.3.6体积排阻色谱复性非还原变性的蛋白质

2.3.7体积排阻色谱复性还原变性的蛋白质

2.3.8反相色谱对非还原变性的蛋白质的复性

2.3.9复性效果评价

第三章结果与分析

第一节蛋白质分子印迹聚合物识别机制研究

3.1.1洗脱液种类对BSA模板分子洗脱效率的影响

3.1.2洗脱液对BSA分子印迹聚合物再结合能力的影响

3.1.3 BSA分子印迹聚合物选择性识别的考察

3.1.4小结

第二节体积排阻色谱法复性蛋白质

3.2.1体积排阻色谱复性非还原变性的蛋白质

3.2.2体积排阻色谱复性还原变性的蛋白质

3.2.3小结

第三节反相色谱法复性蛋白质

3.3.1不同浓度的SDS变性的蛋白质的复性

3.3.2洗脱时间对5％SDS变性的BSA在反相柱上保留的影响

3.3.3流动相的改变对5％SDS变性的Lys在反相柱上保留的影响

3.3.4盐酸胍和脲变性的蛋白质在反相色谱柱上的复性

3.3.5 小结

第四节蛋白质复性的鉴定及复性效果评价

3.4.1反相色谱法鉴定蛋白质复性

3.4.2 Nature-PAGE鉴定蛋白质复性

3.4.3非氧化还原变性的蛋白质复性效果评价

3.4.4 小结

第四章结论

参考文献

致谢

个人简历