菠菜、银杏性别相关的分子细胞遗传学研究及DNA甲基化分析

摘要

植物在漫长的进化过程中产生了性别的分化，在部分高等植物中产生了由性染色体参与的性别决定系统。植物性染色体的相关研究对研究植物性别决定的遗传机制和植物性别的多态性具有重要的意义。对高等植物性染色体及性别决定的研究目前主要集中在XY型的白麦瓶草、木瓜以及X/A型的酸模等几种模式植物上，这些研究为了解植物性染色体的起源和进化及性别决定方式提供了许多重要线索，但由于研究的植物种类有限，研究工作进展缓慢。
　　 目前发现，具有性染色体的植物大多是XY型或X/A型性别决定方式，因而对植物ZW型性别决定方式的研究甚少。银杏为ZW型雌雄异株裸子植物，菠菜为XY型雌雄异株被子植物，对它们进行研究可以填补植物ZW型性别决定方式及Z和W染色体进化研究工作的空白和为X和Y染色体进化的研究提供新的证据；此外，通过对两种实验材料的综合研究，可以比较两种性别决定方式的特点，以及X和Z染色体、Y和W染色体的异同，对全面研究植物性染色体的起源及其在进化过程中发生的进化事件和相应的分子机制具有重要的意义。
　　 本研究应用常规核型分析技术、荧光原位杂交技术和染色体显微分离技术首次对菠菜和银杏性染色体的形态差异性和重复序列组构差异性进行了分析；在分子水平上，首次应用AFLP分子标记技术对菠菜雌、雄基因组DNA差异性进行了研究，并筛选了菠菜性别相关的分子标记；从表观遗传学的角度首次应用MSAP甲基化分析技术对菠菜和银杏雌、雄基因组DNA的甲基化水平差异性和甲基化模式进行了研究，对菠菜和银杏性染色体的甲基化水平和甲基化模式进行了分析，并筛选了性别相关的甲基化差异序列。具体研究结果如下：
　　 1.核型分析显示菠菜雌株的核型模式为2n=2x=（10AA+XX），雄株的核型模式为2n=2x=（10AA+XY），菠菜的X和Y染色体之间也没有明显的形态差异。本研究应用荧光原位杂交技术将25S rDNA在菠菜雌、雄细胞中进行了物理定位，首次发现了菠菜X和Y染色体在形态上的差异。在雌性中期分裂相中检测到6个杂交信号而在雄性中期分裂相中只检测到5个信号，其中X染色体短臂SC区域具有杂交信号，而Y染色体短臂末端没有检测到杂交信号。通过PCR扩增获得了雌、雄株菠菜的ITS序列，其同源性高达99％以上，菠菜X和Y染色体上25S rDNA位点的差异可能是由于性染色体在进化过程中，Y染色体丢失了该rDNA位点所致。
　　 2.通过PCR扩增获得菠菜NTS和5S rDNA序列，并利用多色荧光原位杂交技术首次将25S rDNA、5S rDNA和端粒序列同时定位到菠菜雌、雄细胞中期染色体上，初步尝试建立了菠菜的分子核型。其中X染色体同时具有三种信号，25S rDNA位于短臂末端SC区域，5S rDNA位于长臂近着丝粒区域，端粒序列位于着丝粒区域和染色体端部，而Y染色体相比X染色体缺失了25S rDNA的位点，根据这三种不同颜色信号在染色体上的相对位置和数目可以将性染色体与其它染色体区分开来。
　　 3.核型分析显示银杏雌株的核型模式为2n=2x=（22AA+ZW），雄株的核型模式为2n=2x=（22AA+ZZ），银杏的性染色体是第一对中着丝粒染色体，Z染色体和W染色体的的臂长和臂比没有明显的区别，但随体大小有比较明显的差异，其中Z染色体的随体较小，W染色体的随体较大。应用荧光原位杂交技术将25S
　　 rDNA在银杏雌、雄细胞中进行物理定位，在雌、雄细胞中均检测到了4个信号，其中W染色体上的杂交信号明显大于Z染色体，本研究首次在分子细胞遗传学水平上证实了银杏的性别决定机制为ZW。通过PCR扩增雌、雄株银杏的ITS序列，在雌株中获得了两条ITS序列，其中一条为雌性特异的ITS序列，这也是植物中首次发现的与性别相关的ITS序列，其ITS2序列与雄株中的ITS2序列一致，而ITS1序列则发生了约200 bp的缺失。W和Z染色体上rDNA位点拷贝数的差异是W染色体在进化过程中rDNA的拷贝数增加所致，而在rDNA位点扩增的时候部分序列发生丢失，因此产生了雌性特异ITS序列。
　　 4.利用染色体显微切割技术分离银杏的W染色体，并以W染色体特异序列为杂交探针对银杏的雌、雄细胞中期染色体进行了染色体绘染，结果显示W染色体和Z染色体在其长臂距末端1/2的一段区域杂交信号的强度有明显差异，表明该区域序列组成存在差异，是银杏性染色体上的非配对区域。这是首次利用染色体绘染技术发现的植物性染色体上的非配对区域。序列的差异会导致性染色体的配对抑制，该区域是否为非重组区域还需要进一步研究确定。
　　 5.利用AFLP分子标记技术分析菠菜雌、雄基因组间的差异，共检测1897个位点，其中只有2个位点表现出性别差异，差异位点占检测位点的0.11％，菠菜雌、雄基因组间的AFLP标记的相似率为99.96％。表明菠菜雌、雄基因组DNA间的差异性很小，性别分化处于进化早期。筛选到两个雄性特异的AFLP差异标记BCM-1和BCM-2，经Southern杂交和序列分析，BCM-1是串联重复序列，在雌、雄基因组泳道中均有杂交信号，其中在雄性基因组中有两条特异带；BCM-2在雌、雄基因组泳道中均有杂交信号，但是雄性中的拷贝数明显比雌性的拷贝数多。推测BCM-1和BCM-2在菠菜X和Y染色体上均有同源序列，在进化过程中，位于Y染色体上的序列发生了拷贝数和碱基序列的变化，因此经AFLP分析产生了雄性特异的带型。BCM-1和BCM-2在GeneBank中未发现同源序列，其功能还有待于进一步研究。
　　 6.本研究首次利用MSAP技术对菠菜和银杏的雌、雄基因组的DNA甲基化水平进行分析，在菠菜中共检测了2564个位点，获得14种不同的甲基化类型，其中252个位点为甲基化多态性位点，雌性和雄性的半甲基化率分别为11.14％和11.48％，全甲基化率分别为15.04％和14.44％；在银杏中共检测了1992个位点，14种不同的甲基化类型，其中241个位点为甲基化多态性位点，雌性和雄性的半甲基化率分别为13.22％和11.75％，全甲基化率分别为16.64％和18.08％。雌、雄基因组甲基化水平的差异是由性染色体甲基化水平的差异引起的。通过对菠菜和银杏全基因组甲基化分析发现，XY型雌性基因组半甲基化率低而全甲基化率高，ZW型雄性基因组半甲基化率低而全甲基化率高，两者雌、雄基因组甲基化情况正好相反，这与XY型和ZW型的雌、雄植株中性染色体异配情况相反的现象吻合。
　　 7.对部分MSAP差异片段进行分析，菠菜雌性差异片段MBF1，MBF2和雄性差异片段MBM1和MBM3以及银杏雌性差异片段MYF1，MYF2和雄性差异片段MYM1的A+T含量较高，推测可能为重复序列。经Southern杂交分析，MBF1，MBF2，MBM1、MBM3、MYF1，MYF2和MYM1在雌、雄基因组泳道中均有信号，其中MBF1和MBF2在雌性基因组泳道中信号较强，MYM1在雄性基因组泳道中信号较强，推测MBF1和MBF2是X染色体上的序列，因此在雌株中拷贝数多于雄株，同理，MYM1可能是位于Z染色体上的序列。MBM1和MBM3在雄性泳道中具有特异的杂交带，MYF1在雌性泳道中具有特异的杂交带，推测这三个序列在进化过程中，位于Y或W染色体上的序列发生了拷贝数和碱基序列的变化。MYF2在雌、雄基因组泳道中的杂交信号没有明显的差别，表明它在银杏雌、雄基因组中的甲基化状态不同。MBM2的G+C含量较高，是雄性基因组特有的序列，是否为编码序列还需要进一步研究。以上序列在GeneBank均中未发现同源序列，其功能还有待于进一步研究。
　　 8.综合以上的研究结果，可以看出XY型和ZW型植物的性染色体在起源和进化上都比较相似，它们都起源于一对常染色体，最初的一对原始性染色体具有相似的形态结构，具有原始性染色体的植物，雌、雄基因组DNA序列的差异性很小。在原始性染色体进化成为异形性染色体的过程中，X和Z染色体上没有发现明显的进化事件，而Y和W染色体的进化则比较活跃，发生了重复序列的聚集和丢失等进化事件。随着Y和W染色体的序列组构和功能区域发生改变，XY型的雌性细胞的一条X染色体和ZW型的雄性细胞的一条Z染色体也逐渐产生了失活现象和剂量补偿作用。在XY型植物中，造成雌、雄基因组甲基化水平的差异的主要原因是雌性细胞中的X染色体可能存在大量的与XCI现象有关的全甲基化和超甲基化的DNA甲基化修饰形式，而在Y染色体上可能存在大量的与重复序列的聚集及异染色质化有关的半甲基化的DNA甲基化修饰形式；而在ZW型植物中，Z染色体与X染色体的甲基化情况一致，而W染色体与Y染色体的甲基化情况一致。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 前言

第一节 植物性染色体及性别决定相关研究进展

1.1.1 植物的性别多态性

1.1.2 植物的性染色体

1.1.3 植物的性别决定系统

1.1.4 植物性染色体进化相关研究

第二节 植物性连锁基因研究进展

1.2.1 分离性连锁基因的主要研究方法概述

1.2.2 植物中已分离的性连锁基因

1.2.3 性连锁基因与性染色体进化

第三节 植物性染色体重复序列相关研究

1.3.1 植物重复序列的分类

I.3.2 植物性染色体上的重复序列

第四节 植物DNA甲基化相关研究进展

1.4.1 植物核基因组DNA甲基化的特点

1.4.2 植物核基因组DNA甲基化的发生机制

1.4.3 植物核基因组DNA甲基化的功能

1.4.4 MSAP技术的原理和应用

第五节 菠菜和银杏性别相关研究进展

1.5.1 菠菜性别相关研究进展

1.5.2 银杏性别相关研究进展

第六节 本文选题依据、意义及研究内容

1.6.1 选题意义及依据

1.6.2 研究目的及内容

第二章 材料和方法

第一节 实验材料

第二节 实验试剂

第三节 实验仪器

第四节 实验方法

2.4.1 染色体标本制备

2.4.2 常规核型分析

2.4.3 基因组DNA提取

2.4.425S rDNA探针制备

2.4.5 拟南芥型端粒重复序列制备

2.4.6 ITS序列PCR扩增

2.4.7 NTS序列PCR扩增

2.4.85S rDNA序列PCR扩增

2.4.9 PCR扩增产物克隆和测序

2.4.10 染色体微切及探针制备

2.4.11 染色体荧光原位杂交

2.4.12 Southern杂交

2.4.13 AFLP分析

2.4.14 MSAP分析

2.4.15 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

2.4.16 AFLP/MSAP差异片段的回收、扩增与克隆

第三章 结果与分析

第一节 雌、雄株菠菜和银杏核型分析及性染色体形态观察

3.1.1 菠菜核型分析及性染色体形态观察

3.1.2 银杏核型分析及性染色体形态观察

第二节 25S rDNA在雌、雄菠菜中的定位及ITS序列的分离鉴定

3.2.125S rDNA在雌、雄菠菜中期染色体的定位

3.2.2 雌、雄菠菜ITS序列的分离和鉴定

第三节 25S rDNA在雌、雄银杏中的定位及ITS序列的分离鉴定

3.3.125S rDNA在雌、雄银杏中期染色体的定位

3.3.2 雌、雄银杏ITS序列的分离和鉴定

第四节 雌、雄菠菜的分子核型及5S rRNA基因的分离和鉴定

3.4.1 拟南芥型端粒重复序列的扩增

3.4.2 雌、雄菠菜NTS序列的分离和鉴定

3.4.3 雌、雄菠菜5S rRNA基因的分离和鉴定

3.4.4 rDNA和端粒序列在雌、雄菠菜中的多色荧光原位杂交

第五节 银杏W染色体显微分离及FISH定位

3.5.1 银杏W染色体显微分离

3.5.2 W染色体LA-PCR扩增及Southern印迹分析

3.5.3 W染色体LA-PCR扩增产物的荧光原位杂交

第六节 雌、雄株菠菜基因组AFLP差异分析

3.6.1 雌、雄株菠菜基因组AFLP分析

3.6.2 雌、雄株菠菜基因组AFLP差异片段的序列分析和鉴定

第七节 雌、雄株菠菜基因组DNA甲基化水平及模式研究

3.7.1 雌、雄菠菜基因组DNA的MSAP分析

3.7.2 雌、雄菠菜基因组DNA甲基化水平分析

3.7.3 雌、雄菠菜基因组DNA甲基化不同类型分析

3.7.4 雌、雄菠菜基因组甲基化差异片段的序列分析和鉴定

第八节 雌、雄株银杏基因组DNA甲基化水平及模式研究

3.8.1 雌、雄银杏基因组DNA的MSAP分析

3.8.2 雌、雄银杏基因组DNA甲基化水平分析

3.8.3 雌、雄银杏基因组DNA甲基化不同类型分析

3.8.4 雌、雄银杏基因组甲基化差异片段的序列分析和鉴定

第四章 讨论

第一节 FISH鉴定植物性染色体的优势

4.1.1 利用FISH技术鉴定植物性染色体的可能性

4.1.225S rDNA序列在银杏、菠菜性染色体鉴定中的应用

4.1.3 多色荧光原位杂交建立菠菜性染色体分子核型

4.1.4 染色体微分离及绘染技术在植物性染色体研究中的应用

第二节 菠菜雌、雄基因组DNA差异性研究

4.2.1 分子标记在雌、雄基因组DNA差异分析研究中的意义

4.2.2 AFLP研究雌、雄基因组DNA差异性的可行性分析

4.2.3 菠菜雌、雄基因组DNA差异分析

第三节 菠菜和银杏雌、雄基因组甲基化研究

4.3.1 雌、雄基因组甲基化研究的意义

4.3.2 MSAP研究雌、雄基因组甲基化的可行性

4.3.3 菠菜和银杏雌、雄基因组甲基化水平分析

第四节 植物性染色体进化的可能机制

4.4.1 菠菜和银杏性染色体进化中的重复序列

4.4.2 植物性染色体的起源与进化

第五节 后续研究工作展望

第五章 结论

致谢

参考文献

附录

个人简历