组蛋白H3的磷酸化与细胞有丝分裂的关系研究

摘要

细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一,真核细胞有丝分裂是生物繁殖和生长发育的基础。核小体是构成真核生物细胞染色质的基本结构单位,组成核小体的组蛋白发生形式多样的翻译后修饰,包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化及ADP-核糖基化等。研究表明组蛋白共价修饰的不同种类及时间和空间的不同组合,诱导如DNA复制、转录(基因表达)、遗传重组、细胞分裂等一系列生物学过程。因而这些组蛋白的修饰及组合与它们的生物学功能的关系被称为“组蛋白密码”。 -些研究结果表明,组蛋白H3尾部(氨基末端)的磷酸化作用是发生在细胞有丝分裂过程中的特征性事件。为了研究组蛋白的氨基末端的磷酸化与有丝分裂的关系,在本学位论文的研究中,我们使用同步化、免疫印迹、免疫荧光标记、染色质免疫沉淀和激光共聚焦等技术,研究了组蛋白H3的磷酸化过程与细胞有丝分裂的关系。我们观察了Thr11磷酸化H3在人乳腺癌细胞MCF-7和小麦根尖细胞内的动态分布,以分析其与染色体凝集的关系。研究结果显示,在MCF-7细胞中,组蛋白H3Thr11的磷酸化作用发生在早前期细胞染色体的着丝粒处,成点状分布,继而在早中期达到最高水平,并在中期以点状集中在赤道板上,在后期开始脱磷酸化,并于末期完成脱磷酸化。这与Ser10磷酸化H3定位于染色体的端粒区域明显不同,表明了不同的磷酸化位点在有丝分裂中可能存在着不同的功能。对于中期染色体,我们又通过染色质免疫沉淀(ChIP)实验证明Thr11磷酸化H3特异性的与着丝粒DNA结合,这与前面的免疫荧光结果是一致的。在胞质分裂过程中,我们又发现Thr-11磷酸化H3存在于中体区域,这表明其可能在胞质分裂中起重要作用,后来我们又分析中体复合物的成分证实它确实参与中体的组成。但是它在中体上的的定位与Ser10磷酸化H3同样有着明显不同,Thr11磷酸化H3在中体上呈现对称“钟状”结构,而Ser10磷酸化H3呈一个“棒状”结构处于中央位置,连接着这两个“钟状体”,这个事实表明这两种磷酸化蛋白参与细胞的胞质分裂并有着不同的功能。 本论文研究检测了Thr11磷酸化H3在小麦根尖细胞有丝分裂过程中的动态分布。结果显示在小麦根尖细胞中,组蛋白的磷酸化与脱磷酸化也同染色体的凝集和解凝集过程存在着时间和空间的相关性。这表明,在动植物细胞之间,组蛋白H3 Thr11的磷酸化具有一定的保守性。但是在动植物细胞之间也有区别,在MCF-7细胞中,磷酸化主要发生在着丝粒上,而在小麦根尖细胞中,磷酸化发生于整条染色体上。另外,我们还初步研究了Thr3磷酸化H3在中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)和人乳腺癌细胞(MCF-7)有丝分裂过程中的动态分布,发现其也与染色体凝集存在时间和空间上的相关性,但是它在磷酸化时定位于整个染色体臂,并且其在胞质分裂中不参与“中体”的组成,这与Thr11磷酸化H3和Ser10磷酸化H3是不同的。 研究结果表明,组蛋白H3 Thr11和Thr3的磷酸化与细胞有丝分裂染色体的凝集和解凝集过程有着时间和空间上的相关性。Thr11和Thr3这些位点发生磷酸化作用,可使组蛋白H3氨基末端的正电荷数降低,改变了组蛋白-DNA间的相互作用。组蛋白H3的细胞内整体性磷酸化,可能是导致分裂期细胞染色质凝集的诱发因子,因此组蛋白H3的磷酸化可能导致核小体重构(remodeling)、变构,从而导致染色质凝集。由于发现Thr11磷酸化H3在最终定位于“中体”。这些Thr11磷酸化H3可能来自于特化结构的核小体,可能是磷酸化导致H3的负电荷增加,因而增加与DNA的斥力,导致H3与DNA解离,为染色质重构和凝集提供了条件。但是这个推测尚待进一步证实。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第一节真核生物有丝分裂的过程

第二节染色体基本结构

第三节组蛋白N末端（尾部）修饰和“组蛋白密码”

第四节组蛋白H3的磷酸化作用

第五节着丝粒

第六节中体复合物和染色体过客蛋白复合物

第二章材料与方法

第一节材料与试剂

第二节实验原理与方法

第三章结果与分析

第一节组蛋白H3 Ser10的磷酸化作用

第二节组蛋白H3 Thr11的磷酸化作用

第三节Thr11磷酸化H3特异性的与着丝粒DNA序列结合

第四节Ser10和Thr11磷酸化H3蛋白参与组成中体复合物

第五节组蛋白H3 Thr3的磷酸化作用

第四章讨论

第一节组蛋白H3磷酸化与有丝分裂和染色体凝集的关系

第二节有丝分裂H3磷酸化的生物学功能

第五章结论

参考文献

致谢

附录

个人简历