巴斯德毕赤酵母ppSpt23p对UFA脱氢酶基因调控功能的研究

摘要

近年来，随着越来越多的关于多不饱和脂肪酸(PUFAs)和脂肪酸脱氢酶在食品、医药、保健品等领域的重要作用的揭示，引起了国内外学者的广泛关注。多不饱和脂肪酸是在一种酶复合物的作用下由脂酰链脱氢形成的。脂肪酸脱氢酶在脂肪酸代谢以及维持细胞膜正常结构和功能方面有重要作用。随着越来越多的脂肪酸脱氢酶基因被克隆，这种酶类的酶活反应和相关的代谢途径也越来越清楚，近年来人们也开始关注调控脂肪酸脱氢酶基因表达的调控因子的研究。巴斯德毕赤酵母Gs115(Pichia pastoris)作为一种能够产生多不饱和脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸的酵母菌株，是构建产多不饱脂肪酸的基因工程菌株的较好选择，不饱和脂肪酸脱氢酶基因受多种蛋白因子的调控，为了更好的开发利用此菌，有必要对这些调控因子进行系统的研究。
　　 为研究巴斯德毕赤酵母中调控多不饱和脂肪酸的合成基因的调控因子，根据已报道的真菌来源的Spt23p/Mga2p家族蛋白同源序列中保守的氨基酸序列设计简并引物，以巴斯德毕赤酵母的cDNA为模板进行PCR，结果得到全长为1291bp，编码430个氨基酸的片段。通过其编码的氨基酸序列的相似性搜索表明，所扩增片段为新的潜在的SPT23基因的部分DNA序列。在此基础上，采用接头PCR的方法共得到全长为5742bp的核苷酸序列信息，其中包括3288bp的氨基酸编码区和624bp的潜在上游启动子区。同其他已报道的Spt23p氨基酸序列对比的结果表明：该序列可能编码一个完整的Spt23p蛋白。此基因命名为ppSPT23，其编码蛋白命名为ppSpt23p。为了验证所获得基因ppSPT23的功能，以酿酒酵母INVScl为出发菌株，利用同源重组的方法构建scSPT23/scMGA2基因双缺失的酿酒酵母INVScl spt23△：：LEU；mgα2△：：TRY。以此菌作为ppSPT23基因功能验证的受体菌，构建表达质粒pYES-ppSPT23，转入酿酒酵母spt23△：：LEU；mgα2△：：TRY中，进行异源表达，通过涂布平板实验表明，ppSPT23基因可以在spt23△：：LEUmgα2△：：TRY菌中表达，并且可以使缺失株在不加油酸的平板上恢复生长，表明克隆得到的新基因可以激活△9-脂肪酸脱氢酶的表达。该基因序列已经注册到NCBI的GenBank中(序列接收号为序列接收号为EU86136)。
　　 为了进一步研究ppSPT23基因的功能，其对不饱和脂肪酸脱氢酶基因表达的影响，利用同源重组介导敲除的办法构建了巴斯德毕赤酵母ppSPT23基因缺失突变株△ppspt23，并对缺失突变株的总脂肪酸进行了GC分析和Southern杂交验证。GC分析分析结果说明如果ppSPT23基因的功能遭受破坏，将阻止△9-月旨肪酸脱氢酶的表达，C18：0无法转变成C18：1。同时，缺失株中C18：2的含量明显低于野生型，说明ppSPT23基因缺失，也会抑制△12-脂肪酸脱氢酶的活性，而C18：3的含量，缺失株比野生型略高一些，说明，ppSPT23基因缺失，不会抑制ω3-脂肪酸脱氢酶的活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 引言

第一节 不饱和脂肪酸的研究概况

1.1.1 多不饱和脂肪酸的基本概念和种类

1.1.2 PUFAs的代谢途径

1.1.3 PUFAs的功能

1.1.4 真菌中和藻类的PUFAs的生物合成

第二节 脂肪酸脱氢酶基因的分子生物学研究进展

1.2.1 脂肪酸脱氢酶基因概述

1.2.2 脂肪酸脱氢酶基因研究的常用方法

1.2.3 △9-脂肪酸脱氢酶基因

1.2.4 △12-脂肪酸脱氢酶

1.2.5 ω3-脂肪酸脱氢酶

第三节 脂肪酸脱氢酶基因表达调控因子的研究进展

第四节 选题依据和技术路线

1.4.1 选题依据

1.4.2 技术路线

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 质粒

2.1.3 PCR引物

2.1.4 主要试剂

2.1.5 主要仪器

第二节 实验方法

2.2.1 培养基和试剂的配制

2.2.2 酵母基因组的提取方法

2.2.3 spt23△∷LEU;mga2△∷TRY酿酒酵母(INVSc)菌株构建

2.2.4 酿酒酵母spt23△∷LEU;mga2△∷TRY缺失突变株回补质粒的构建

2.2.5 spt23△∷LEU;mga2△∷TRY缺失突变株的回转验证

2.2.6 毕赤酵母ppSPT23基因部分cDNA序列的PCR扩增

2.2.7 3 ’下游DNA片段和5’上游DNA片断扩增

2.2.8 序列分析软件

2.2.9 巴斯德毕赤酵母ppSPT23基因在酿酒酵母中的的功能验证

2.2.10 ppSPT23基因调控功能研究

第三章 结果与分析

第一节 spt23△∷LEU;mga2△∷TRY酿酒酵母(INVSc)菌株构建

3.1.1.敲除载体构建

3.1.2 酿酒酵母scSPT23/scMGA2基因的敲除及验证

3.1.3 spt23△∷LEU;mga2△∷TRY缺失突变株的回补验证

第二节 巴斯德毕赤酵母ppSPT23基因克隆、序列分析及功能验证

3.2.1 毕赤酵母基因组DNA的提取和检测

3.2.2 巴斯德毕赤酵母RNA的提取和检测

3.2.3 部分cDNA序列的PCR扩增

3.2.4 序列分析

3.2.5 3’下游和5’上游DNA序列的PCR扩增

3.2.6 巴斯德毕赤酵母ppSPT23基因开放阅读框序列扩增

3.2.7 巴斯德毕赤酵母ppSPT23基因的功能验证

第三节 巴斯德毕赤酵母ppSPT23基因敲除及其对多不饱和脂肪酸调控功能的研究

3.3.1 敲除载体的构建

3.3.2 阳性敲除质粒的筛选和用于同源重组片段的获得

3.3.3 毕赤酵母ppSPT23基因的敲除

3.3.4 ppSPT23基因缺失对菌体生长的影响

3.3.5 巴斯德毕赤酵母△ppspt23缺失突变株的回补

3.3.6 ppSPT23基因的回补表达检测

3.3.7 ppSPT23基因缺失对多不饱和脂肪酸脱氢酶表达的影响

第四章 讨论

第一节 ppSPT23基因所编码蛋白结构分析

第二节 ppSpt23p功能分析

第五章 小结

参考文献：

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果