两株阿特拉津降解细菌的分离和热稳定氰尿酸水解酶的鉴定

摘要

阿特拉津(atrazine)，化学名2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪，商品名莠去津，是一种在世界范围内广泛使用的三嗪类除草剂，主要用于玉米、高粱、柑橘和甘蔗地的杂草防除。这种除草剂的大量使用，造成对土壤、表面水和地下水的污染。研究表明，阿特拉津是一种内分泌干扰剂，它能干扰激素调节功能，长期接触会导致人和动物卵巢癌、乳腺癌和白血病的发生，引起人和两栖动物的生殖缺陷和体重减轻。因此，阿特拉津的生物降解和污染环境的生物修复研究对生态安全和人类健康具有重要意义。
　　 用富集培养法，从农药厂废水中分离出能以阿特拉津为唯一氮源生长的节杆菌(Arthrobacter sp.)AD26菌株。阿特拉津降解基因检测表明，Arthrobacter sp.AD26含有trzN-atzBC基因，能将阿特拉津降解成氰尿酸。与两个阿特拉津降解的模式菌株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ADP和金黄节杆菌（Arthrobacter aurescens）TC1相比，AD26的阿特拉津降解性能更好。在无机盐培养基中培养72 h以后，AD26能将初始浓度为500 mg/L的阿特拉津降解95％；生物修复实验表明，AD26培养20 d后能将土壤中300 mg/kg的阿特拉津去除98%。序列分析表明，AD26的trzN基因与TC1的trzN基因存在一个碱基的差异，AD26的第907位碱基为A，密码子编码的氨基酸为亮氨酸，TC1的第907位碱基为T，密码子编码的氨基酸为甲硫氨酸。AD26的TrzN的粗酶活是TC1的1.2倍，推测这可能是由于编码基因的一个碱基突变所引起。
　　 由Arthrobacter sp.AD26和Pseudomonas sp.ADP组成的混合菌株，在以阿特拉津为唯一氮源、蔗糖为碳源的基本培养基中培养时，对阿特拉津的降解发生互补和增强作用。AD26在降解阿特拉津的过程中将蔗糖降解成葡萄糖和果糖，为ADP提供可利用的碳源；ADP将大部分的AD26降解阿特拉津的产物氰尿酸进一步降解成NH3和CO2。在接种量和培养条件相同的情况下，混合菌株的阿特拉津降解能力明显好于AD26和ADP单菌。这表明混合菌株在阿特拉津废水处理和污染土壤的生物修复中有很好的应用潜力。
　　 从工业废水中分离出能完全降解阿特拉津的菌株产碱杆菌(Alcaligenes)SG1，它含有阿特拉津降解基因atzABC和trzD。SG1能以阿特拉津为氮源，葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖和丙酮酸钠等为碳源生长。铵态氮(NH4Cl)、硝态氮(KNO3)能促进SG1的生长，而且不抑制阿特拉津的降解，当阿特拉津含量为200 mg/L时于30℃震荡培养16h后，98%的阿特拉津被降解，其阿特拉津降解不受外加氮源影响这一性质有别于Pseudomonas sp.ADP。在用RT-qPCR方法检测Alcaligenes sp.SG1和Pseudomonas sp.ADP中atzA基因在不同氮源存在时的表达水平时发现，atzA基因在两个菌株中都有基本表达，且受阿特拉津诱导，唯一不同的是，ADP以阿特拉津为唯一氮源时atzA基因的表达水平是阿特拉津和KNO3同时为氮源时的两倍。而SG1以阿特拉津为唯一氮源时atzA基因的表达水平与阿特拉津和KNO3同时为氮源时atzA基因的表达水平基本相同，说明SG1的atzA基因表达不受外加氮源的影响。与其它大多数阿特拉津降解菌株（外加氮源抑制阿特拉津降解）相比，SG1菌株在用于污染土壤的生物修复时有更大的优越性。
　　 氰尿酸是许多三嗪类化合物降解的中间产物。可以被氰尿酸水解酶进一步降解。在用二氯或三氯异氰尿酸对游泳池进行消毒时，氰尿酸会在游泳池中积累，从而使二氯或三氯异氰尿酸不能进一步脱氯而失去消毒功能．本研究用PCR方法，从热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica) ATCC39073菌株中克隆到氰尿酸水解酶基因Moth-2120，并在大肠杆菌中获得高效表达。对表达的氰尿酸水解酶TrzD-Moth进行了纯化和酶学性质研究。研究表明，TrzD-Moth催化反应的最适pH为8.0，最适温度为70℃。底物特异性研究表明，该酶能以氰尿酸和N-甲基异氰尿酸作为底物进行酶促反应。此外，该酶的催化活力不需要金属和其它可以识别的辅因子。在以氰尿酸为底物，30℃、25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)为反应溶液的条件下，TrzD-Moth催化氰尿酸发生反应的Vmax为28.17μmol/min/mg，Km为125μmol/L。这是第一个鉴定的热稳定氰尿酸水解酶，在氰尿酸的生物修复中有很好的应用前景。