生物配体模型(BLM)对于评价金属联合毒性的适用性研究

摘要

在受污染的环境中,金属通常是相互混合并且相互作用的。然而,目前对污染物的风险评价通常还是以单一污染物的效应评价为基础的。近年来,生物配体模型(Biotic Ligand Model,BLM)由于其在金属水质标准制定以及生态风险评价中的应用而日益受到重视。BLM的方法具备应用于混合金属风险评价的能力,但其无法被简单直接的应用于金属混合物效应的评价,而且目前仍不清楚模型的一些简单假设能否满足混合金属复杂的相互作用。因此,应当谨慎地将BLM的方法应用于金属相互作用的模拟。本文简要的介绍了BLM的发展以及理论基础,在对模型的优势和应用中存在的问题进行分析的基础上,对模型的应用范围进行了探索性的研究。首先,以天津地区的一系列景观水体与实验室配制的模拟溶液为例,对已开发的应用于大型溞(Daphnia magna)的急性Zn-BLM的预测能力进行评价。其次,尝试将BLM的方法应用于斑马鱼胚胎毒性的预测,以探讨将模型推广到其他生物(或其他发育阶段)的适用性。为探明Ca2+浓度增加是否会使鱼类早期发育阶段对铅毒性的敏感性升高,以及Ca2+单独减弱铅毒性的浓度范围,选用斑马鱼胚胎作为实验材料,记录在不同的水化学参数条件下,胚胎发育过程中一些具有代表性的毒理学终点,采用相对易于观察且敏感的指标--72 h孵化率进行分析。论文重点探讨了量化微量营养元素铜(Cu)与非必需金属铅(Pb)积累的相互作用,以验证BLM的一些基本假设。在人工配置的已知离子浓度的实验溶液中,采用野生型淡水单细胞绿藻Chlamvdomonas reinhardtii做短时积累实验,暴露浓度范围是5×10-8至5×10-6M,同时测定Pb和Cu单独存在时的内化通量,以使用常数的倒数来确定Michaelis-Menten稳定常数。在此基础上,论述BLM是否具有预测另一种生物效应--基因表达的潜力。研究不同Cu和Pb的浓度下,绿藻生物积累和与金属效应相关的基因表达的变化。着重研究以下几个基因,编码:自然抵抗联合巨噬细胞蛋白(natural resistance associated macrophage protein,nramp1),铜传输位点(copper transporter,ctr2),氧化压力效应基因--谷胱甘肽过氧(化)物酶(glutathione peroxidase,gpx5),以及谷胱甘肽转移酶(glutathioneS-transferase,gsts2)。研究采用Visual MINTEQ version2.5.2进行BLM的相关计算以及金属与溶液中离子的化学形态分析。本文的研究结果可以用来扩展BLM对于金属混合物的预测能力,从而提高该模型预测金属混合物毒性的能力。
　　 论文研究结果表明:
　　 (1)在测试的水化学参数范围内,认为以锌对大型蚤的急性毒性数据建立起来的模型是一种有用的工具,能够在锌的生态风险评价中考虑生物有效性的问题,对所有水体(包括不同稀释倍数的水样)的预测结果与测试结果近似,80％的实测值在预测值67％～150％范围内。但以鱼类为基础开发的,通过下调LA50被应用于水蚤的急性Zn-BLM的预测值普遍高于实测值,其实测值为预测值的约2至4倍。通过调整LA50拓展模型适用性的方法过于简单,正受到质疑。
　　 (2)当Ca2+浓度从0.25 mmol/L增加到2.00 mmol/L时,导致了以自由铅离子活度({Pb2+})和溶解态铅总浓度([Pb]T)表示的72-h EC50的增加(表现为发育延迟),两者之间存在良好的线性关系。通过这一线性关系,可以对Ca2+浓度对铅毒性的影响进行预测。这一结果支持了生物配体模型(BLM)概念的假设,说明在胚胎的表面,铅离子与钙离子可能在传输和毒性作用位点上存在竞争作用。而当Ca2+浓度从2.00 mmol/L增加到4.00 mmol/L时,72-h EC50{Pb2+}和72-h EC50[Pb]T并没有显著的增加。
　　 (3)Cu的稳定常数为105.8M-1,与Pb的常数(105.9M-1)相似。然而,竞争实验没有表现出直接的拮抗作用,这与BLM的预测不符。当Pb存在时,在高浓度条件下,Cu的积累会由于Pb的影响而降低,但当Cu的浓度低于10-7M时,Cu的积累不受Pb的影响。在高浓度的Cu(>1μM)条件下,Cu表现出竞争抑制；而在低Cu条件下,Cu对Pb的积累有协同效应,这种协同效应无法用BLM的观点解释。为了解释这一效应,进一步进行了细胞活动能力试验,膜渗透性试验以及基因表达试验。在Pb存在的条件下,ctr2(一段编码Cu传输位点的基因)的表达增加,表明生物积累是一个比模型假设更加复杂的动态过程。
　　 (4)不同基因会产生不同的相互作用,表明每种基因都可能会产生其特异的细胞内的反馈与调节,这也会与不同的金属有关。这与稳定状态模型的一个假设不符:在敏感位点上不会引起显著的生物调节。即使在短时间的暴露实验中,仍然难以满足该假设。不同金属传输位点所出现的效应不同(ctr2和nramp1),表明传输分子发生了调解与改变。而且,BLM的假设认为金属的生物效应是由于金属富集在生物配体上所产生的,是金属积累的函数。虽然金属必须先积累在生物体中才能产生生物效应,但如仅简单认为金属的积累与其毒性效应之间存在着某种比例关系,这一假设显然太过于简单。Cu的保护效应,表明重金属的积累并不是总与毒性相关,这与BLM的假设不一致。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

第一节 生物配体模型的理论基础

1.1.1 模型的基本概念

1.1.2 重金属形态和生物毒性的关系

1.1.3 模型的理论框架

1.1 ,4模型的原理

1.1.5 模型的假设

1.1.6 模型的实现

第二节 生物配体模型的发展

1.2.1 模型发展的历史

1.2.2 模型发展的现状

第三节 生物配体模型的优势

1.3.1 考虑了特定地点水质的重要影响

1.3.2 有助于标准的制定(考虑生物有效性)

1.3.3 节约成本

1.3.4 提供机理性的解释

1.3.5 金属的生态风险评价

第四节 应用中存在的问题及发展趋势

1.4.1 应用中存在的问题

1.4.2 模型的发展趋势

1.4.3 对金属的联合作用缺乏考虑

第五节 研究目的及研究思路

1.5.1 研究背景

1.5.2 研究的目的及意义

1.5.3 研究内容及技术路线

参考文献

第二章 两种生物配体模型(BLM)预测锌(Zn)对大型溞急性毒性的比较

第一节 研究背景

第二节 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 水样的采集

2.2.3 溶液的制备

2.2.4.毒性试验

2.2.5 数据处理

第三节 结果分析

2.3.1 锌生物毒性的实测和预测结果

2.3.2 不同生物配体模型预测结果的比较

第四节 讨论

第五节 小结

参考文献

第三章 Ca2+与Pb2+相互作用对斑马鱼胚胎毒性效应的影响

第一节 研究背景

第二节 材料与方法

3.2.1 实验生物

3.2.2 化学试剂

3.2.3 实验设计

3.2.4 毒性实验

3.2.5 数据处理与统计

第三节 结果与分析

第四节 讨论

第五节 小结

参考文献

第四章 生物配体模型(BLM)应用于金属混合物的适用性研究-以铅和铜的生物积累为例

第一节 研究背景

第二节 材料与方法

4.2.1 绿藻的培养

4.2.2 实验准备

4.2.3 生物积累实验

4.2.4 细胞活性实验

4.2.5 膜的渗透性实验

4.2.6 基因表达

4.2.7 数据处理与分析

第三节 结果与讨论

4.3.1 Pb和Cu的生物积累

4.3.2 Pb对Cu吸收的影响

4.3.3 Cu对Pb吸收的影响

4.3.4 低Cu浓度下BLM的局限性

4.3.5 细胞生存能力及膜渗透性实验

4.3.6 Cu的吸收位点

4.3.7 Cu的调节

第四节 小结

参考文献

第五章 铅、铜暴露下绿藻的基因表达

第一节 研究背景

第二节 材料与方法

5.2.1 绿藻的培养

5.2.2 实验设计

5.2.3 生物积累实验

5.2.4 RNA的提取

5.2.5 基因表达

5.2.6 数据处理与分析

第三节 结果

5.3.1 时间系列试验

5.3.2 单一金属暴露实验

5.3.3 混合金属暴露实验

5.3.4 模型预测

第四节 讨论

5.4.1 金属对铜传输位点的影响(CTR2)

5.4.2 金属对二价金属传输位点的影响(NRAMP1)

5.4.3 金属对氧化压力效应基因的影响(GPX5和GSTS2)

参考文献

第六章 总结与展望

致谢

附录 A 细胞活性实验方法

附录 B 基因表达定量试剂系统(QuantiGene()2.0 Reagem System)

B.1机理

B.2实验设计

B.3实验步骤

B.4数据分析

B.5优化样品量

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果