阿特拉津氯水解酶基因的遗传转化与定向改造研究

摘要

阿特拉津(atrazine)，化学名2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5三嗪，商品名莠去津，是一种世界范围内广泛使用的三嗪类除草剂，主要用于玉米、高粱、甘蔗、柑橘等抗阿特拉津作物田间阔叶杂草和禾草的防除。由于阿特拉津的使用量大、使用范围广、在土壤中降解速度缓慢（半衰期可长达57周），已经对土壤、地下水和地表水造成污染，在一些污染严重的地区，其浓度远远超过美国规定的3μg/L的最大允许值。近几年研究表明，阿特拉津能引起两栖动物的生殖缺陷；干扰哺乳动物体内性激素的分泌调节及免疫系统调节，造成繁殖异常和免疫系统紊乱；长期接触阿特拉津，可导致人类卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病患病几率增加。阿特拉津的广泛使用，已经对生态环境和人类健康造成极大的威胁，对阿特拉津污染环境的修复和治理是目前急需解决的实际问题。
　　 阿特拉津氯水解酶(Atrazine ehlorohydralase，简称AtzA，E．C-3.8.1.8)能催化阿特拉津的水解脱氯反应，使有毒的阿特拉津变为无毒的羟基阿特拉津，对阿特拉津的生物降解和环境净化有重要意义。
　　 将来源于假单胞菌(Pseudomonas sp.) ADP和节杆菌(Arthrobacter sp.) AD1的阿特拉津氯水解酶基因atzA-ADP和atzA-AD1分别重组到植物表达载体pBin438上，用农杆菌介导法转化进烟草(Nicotiana tabacum L. cv.Samsun)中，通过烟草植株再生，共得到72株atzA-ADP转化植株和64株atzA-AD1转化植株。基因组PCR分别筛选得到42株转atzA-ADP阳性植株和38株转atzA-AD1阳性植株，阳性转化率分别为58.3％和59.4%。RT-PCR对筛选得到的阳性转化植株检测结果显示，16株转atzA-ADP阳性植株和12株转atzA.AD1阳性植株中的atzA能够在转录水平表达。
　　 对其中3株检测信号较强的转atzA-ADP阳性植株401、402、403和4株检测信号较强的转atzA-AD1阳性植株701、702、703、704的T1代进行Southernblot分析显示，atzA已经整合到烟草基因组中并稳定遗传到后代。7株转基因株系T1代种子经150 mg/L阿特拉津处理后，发芽率比同样浓度阿特拉津处理的野生型烟草种子高20%左右。基因组PCR对T2代转基因株系的检测发现，atzA能够在转基因烟草株系基因组中稳定遗传。7株转基因株系T2代植株在含2mg/kg阿特拉津的土壤中仍能正常生长，其株高是经同样浓度阿特拉津处理的野生型烟草植株的2.2-2.7倍，生物量是野生型的2.3-3.4倍；对转基因株系及野生型烟草叶片中叶绿素含量测定结果显示，经阿特拉津处理的野生型烟草叶片中叶绿素含量较不加阿特拉津正常生长的烟草植株下降了34%，而同样浓度阿特拉津处理的转基因株系叶片中叶绿素含量与不加阿特拉津处理时无明显差异，表明阿特拉津对转基因株系的光合系统没有造成破坏。
　　 T2代转基因烟草株系对土壤中阿特拉津的降解分析结果显示，在含2mg/kg阿特拉津的土壤中培养90d时，野生型株系的土壤中有74.1%阿特拉津残留，而转基因株系土壤中没有检测到阿特拉津残留。说明转atzA烟草株系能够对土壤中高浓度阿特拉津进行有效降解，在阿特拉津污染土壤的植物修复中具有很好的应用潜力。
　　 尽管已经从不同的细菌中获得了atzA，但由于它们之间的同源性非常高，编码酶的性能差异很小，因此限制和影响了该酶的开发应用。对现有的基因进行改造，不仅有望获得酶活力大大提高的新酶，而且有助于对酶的结构功能关系进行分析。
　　 利用EP-PCR(错误倾向PCR)和DNA shuffling(DNA洗牌或DNA重组)相结合的突变技术，对来源于假单胞菌ADP和节杆菌AD1的阿特拉津氯水解酶基因atzA-ADP和atzA-AD1进行随机突变，然后以雨生红球藻为受体，以阿特拉津为筛选压力对atzA突变文库进行筛选。本实验从0.5ug/mL（临界浓度的5倍）阿特拉津筛选压力下得到了7个突变子，7-10、15-1、16-1、21-1、40-8、48-6和49-10;从1.0μg/mL（临界浓度的10倍）阿特拉津筛选压力下得到了5个突变子10-7、10-15、22-4、22-11和32-2。序列分析显示，AtzA突变位点分散在全基因上，通过逐渐累积所形成，类型以点替换为主。其中10-7/10-15、22-4/22-11、-40-8/-48-6/-49-10氨基酸突变位点相同。高压液相色谱法分别检测突变子对阿特拉津的酶活力，同时与野生型AtzA进行比较。结果显示，培养液中添加1.0mg/L阿特拉津时，22-4、10-7和21-1酶活力均为野生型的3倍以上，其余突变子相对活力介于1.8-2.3倍之间；培养液中添加2.0mg/L阿特拉津时，22-4、48-6、10-7、32-2、21-1和16-1酶活力均为野生型的2倍以上，15-1和7-10相对比活力分别为1.8倍和1.7倍；向含有3mg雨生红球藻总蛋白的粗提液中加入0.6mg阿特拉津时，10-7、21-1、32-2、16-1、22-4和48-6酶活力均为野生型的2倍以上，15-1和7-10相对比活力分别为1.8倍和1.7倍。分别将atzA突变基因克隆到pET41a(+)表达载体上并转化进大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，以包涵体形式表达的AtzA经过变性、复性及纯化后测定酶活力，并与野生型AtzA进行比较，结果显示，所得突变子的酶活力为野生型的1.5-4.1倍。这些突变子的获得，不仅建立了简单灵敏的雨生红球藻筛选系统，还将为AtzA的结构功能关系研究提供可靠的实验依据。