线粒体外膜转位因子Tom40在大肠杆菌中的表达和重新折叠的研究

摘要

线粒体内含有1000-1500种蛋白质，除参与氧化磷酸化的13种多肽外，98％以上的蛋白质都是由细胞核基因编码，经转录、翻译并在细胞质核糖体中以前体形式合成后，再转运进入线粒体的。研究表明，在线粒体内膜和外膜上存在一系列涉及蛋白质转运的蛋白质复合物，称为转位因子(translocatior，又称为translocase)，主要包括外膜的TOM复合体和SAM复合体，内膜的TIM23复合体、TIM22复合体和OXAI复合体，它们在结构上都由受体和供蛋白质通过的孔道两部分构成。其中TOM转运复合体是线粒体蛋白进入线粒体的第一道屏障，当前体蛋白由细胞质基质移向线粒体表面时，TOM复合体就会对其进行识别及转运，根据前体蛋白的识别情况，前体蛋白分为三种类型：(1)无前序列，Tom70依赖的前体蛋白；(2)含前序列，Tom70依赖的前体蛋白；(3)含前序列，非Tom70依赖的前体蛋白。
　　 Tom40蛋白是TOM转运复合体的核心组分，它与受体蛋白Tom22及小Tom蛋白，Tom5、Tom6、Tom7稳定结合，共同形成400kDa的整体输入孔道——GIP复合体(General Import Pore)。对线粒体蛋白通过TOM复合体的转运起着至关重要的作用。尽管近年来人们对TOM复合体及其亚基转运蛋白的功能进行了大量的研究，然而由于其核心亚基Tom40的三维空间结构尚未解析出来，其转运蛋白的机理尚不清楚。在本研究中，我们尝试用大肠杆菌表达系统大量的表达大鼠Tom40蛋白(rTom40)，发现该蛋白以包涵体的形式存在，于是我们对表达的包涵体进行变性溶解后再进行纯化工作，在纯化的同时透析去除变性剂使蛋白重新折叠。随后，利用圆二色光谱(CD)和高灵敏度微热量分析(VP-DSC)技术对重新折叠的蛋白进行分析，结果表明重新折叠的rTom40蛋白具有明显的二级结构和紧凑的三级结构；而拓扑结构的预测也显示了其结构特性；最后，在此基础上，我们尝试摸索rTom40蛋白晶体的生长条件，为进一步优化结晶条件，进行三维空间的结构解析奠定了重要的物质基础。