人源N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(OGA)的原核表达、催化机理研究及多克隆抗体的制备

摘要

0-连接N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAe)修饰广泛地存在于真核生物中，对细胞质与细胞核内蛋白的Ser/Thr进行单糖基化修饰，与磷酸化相似，是一种广泛、动态的蛋白质翻译后修饰方式，参与基因转录、信号转导、蛋白质降解等多种生命活动的调控。O-GIcNAc修饰水平与多种疾病，如II型糖尿病、老年神经退行性疾病以及和癌症的发生都有密切关系。
　　 蛋白上O-GIcNAc的添加和移除分别是由β-N-乙酰葡萄糖胺糖基转移酶(OGT)和β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(O-GlcNAcase，OGA)催化完成的。为阐明OGA催化的机理和对O-GIcNAc修饰的调控机制，我们通过PCR克隆了人源OGA cDNA基因的三个片段：全长foga(编码1-916 aa)，yoga(编码1-677 aa)及soga(编码1-350 aa)，并分别连入原核表达载体pET-28a中，在大肠杆菌BL21菌株中分别进行诱导表达；通过优化IPTG浓度、诱导时间等，找到了最优的诱导条件，使得各OGA片段的表达量及可溶性都得到了改善。按照优化后的条件对三种OGA片段进行大规模诱导表达，并通过Ni柱亲和纯化得到了纯度较好的目的蛋白，能够用于生化研究和酶活测定。
　　 以4-甲基伞形酮-乙酰氨基葡萄糖(4-MU-GIcNAc)为底物，分别测定三种纯化后的OGA片段的β-N-乙酰葡萄糖糖苷酶活性，结果显示三种OGA片段均具有活性，fOGA、vOGA、sOGA的‰值依次增大，Kcat值依次减小，表明N端结构域即sOGA是糖苷酶活性中心，能够独立发挥催化功能；C端结构域可以稳定全长蛋白的三维结构，并对糖苷酶活性的发挥有着重要的辅助作用。但C端结构域的作用机制仍有待于OGA结构的解析。
　　 确定sOGA具备独立催化能力之后，我们利用已解析的OGA同源结构对其进行同源建模，得到了sOGA的三维结构模型；通过分子对接，模拟出OGA抑制剂PUGNAc与活性中心的相互作用模型；并根据该模型得到了7个可能在催化过程中起关键作用的氨基酸：Y69、D174、D175、Y219、C215、N280、D285。利用定点突变PCR的方法，我们分别对其进行突变：Y69F、D174N、D175N、C215A、Y219F、N280A、N285A，将不同的突变体进行克隆表达、纯化和酶活测定，实验结果显示各突变体的活性均较野生型有不同程度(4-2000倍)的降低，表明各氨基酸均在OGA发挥催化功能过程中发挥重要的作用，该实验为深入研究OGA的催化机理奠定了基础。为了进一步研究OGA的体内生物学作用，我们以纯化的sOGA作为抗原，免疫兔子并通过亲和纯化成功得到了多克隆抗体，western blotting结果显示制备的抗体能够特异性识别各种长度的OGA变体，为后续的其他相关生物学实验提供了可能。