乙肝病毒X蛋白通过长非编码RNA HULC促进肝癌细胞增殖的作用及分子机制研究

摘要

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是导致肝细胞肝癌(HCC)的发生的重要原因，乙肝病毒X蛋白(HBx)在HCC的发生发展过程中发挥重要的作用。HBx蛋白对于HBV本身复制具有重要作用，具有反式激活功能，通过与多个癌基因相互作用和参与细胞信号转导通路来影响细胞周期，进而影响细胞的增殖，同时也能与转录因子结合直接调控下游基因的转录。长非编码RNA(Longnon coding RNA，LncRNA)可通过多种途径调节靶基因表达，参与调控细胞的生长、发育、衰老和死亡等过程。LncRNA可通过干扰转录、引起染色体重塑、组蛋白修饰、改变蛋白质定位和调节蛋白质活性等调节作用发挥功能。LncRNAHULC(highly7up-regulated in liver cancer，HULC)是一种在肝癌中高表达的长非编码RNA，但其在肝癌发生发展过程中的作用迄今不清。为了进一步阐明长非编码RNA HULC是否参与HBx致癌的过程，本文探讨了LncRNAHULC在HBx促进肝癌细胞增殖的作用及其分子机制。主要内容如下：
　　 第一部分：HBx上调HULC的作用及其分子机制首先，通过Real-time PCR检测了21例临床肝癌组织和其癌旁组织中HULC的表达水平。结果显示，与癌旁相比HULC在肝癌组织中高表达。在33例肝癌标本(包括上述21例肝癌组织)中发现HBx mRNA的表达水平与HULC的表达水平呈正相关。Real-time PCR结果显示，与对照组相比HULC在稳定转染HBx的肝细胞L-O2-X和肝癌HepG2-X细胞中表达上调，通过RNA干扰HBxmRNA，可下调HULC的表达，呈剂量依赖性；在人永生化肝细胞L-O2中瞬时转染HBx，HULC的表达水平发生上调，呈剂量依赖性。为了进一步研究HBx上调HULC的分子机制，首先克隆了HULC的启动子核心区，双荧光素酶报告基因检测发现，在L-O2细胞中过表达HBx可激活HULC启动子的活性，呈剂量依赖性，而在HepG2-X细胞中干扰HBx mRNA后HULC的表达水平发生下调，呈剂量依赖性。HULC启动子区含有cAMP response element-binding(CREB)结合位点。当干扰CREB mRNA或将HULC启动子的CREB结合位点突变，应用双荧光素酶报告基因检测发现，L-O2-X和HepG2-X细胞中HULC的启动子活性明显下降。应用染色质免疫共沉淀实验进一步证实，HBx可通过直接结合转录因子CREB上调HULC的表达。
　　 第二部分：LncRNA HULC促进肝癌细胞增殖的作用HULC对肝癌细胞调节的功能不清。为了探讨HBx是否通过HULC促进肝癌的发生发展，应用MTT方法检测了瞬时过表达HULC对L-O2肝细胞增殖的影响。结果显示，过表达HULC可明显促进肝细胞增殖，呈时间依赖性；反之，在L-O2-X和HepG2-X中干扰HULC则可抑制上述细胞的生长，呈时间依赖性。EdU检测显示，在HepG2-X细胞中干扰HuLC可显著抑制肝癌细胞的增殖；克隆形成实验显示，在HepG2-X细胞中干扰HULC可明显降低细胞的克隆形成能力；裸鼠动物成瘤实验结果显示，在HepG2-X细胞中干扰HULC可显著降低肝癌细胞的成瘤能力，进一步应用Realtime PCR检测，与对照组相比在移植瘤组织中HULC的水平明显降低。因此，LncRNA HULC具有促进肝癌细胞增殖的作用。
　　 第三部分：LncRNA HULC促进肝癌细胞增殖分子机制的研究为了进一步研究LncRNA HULC促进肝癌细胞增殖的分子机制，通过检索HULC基因所在的6p24.3区域的编码基因，发现HULC基因附近存在SLC3583和抑癌基因p18两个编码基因。文献报道，HULC对SLC3583调节作用并不明显，因此我们探讨了HULC对p18的调控作用。我们首先检测了上述21例肝癌组织和癌旁组织中p18的表达水平，发现p18在肝癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织，并且在上述33例肝癌组织中发现p18的表达水平与HULC的表达水平呈负相关。在HepG2细胞中干扰HULC，显示p18的mRNA水平和蛋白水平发生上调，呈剂量依赖性。将p18基因(-1003到+349nt)克隆到pGL3-Basic载体上，报告基因结果显示，该区域具有启动子活性。报告基因显示，在肝细胞L-O2中过表达HULC可抑制p18的启动子活性，呈剂量依赖性；当干扰HepG2细胞中HULC，可激活p18的启动子活性，呈剂量依赖性。上述结果表明，HULC通过抑制p18基因的启动子活性进而抑制p18的表达。MTT分析结果显示，双干扰p18和HULC，发现干扰HULC可以降低干扰p18促进细胞增殖的能力。检测动物实验肿瘤组织中p18的表达水平，结果显示在si-HULC组的移植瘤组织中p18蛋白的表达水平明显高于si-Ctrl组，进一步证实了si-HULC抑制肝癌细胞增殖的作用与上调p18有关。
　　 第四部分：HULC和p18在HBx促进肝癌细胞增殖中的作用为了探讨HULC和p18在HBx促进肝癌细胞增殖中的作用，对L-O2/L-O2-X(HepG/HepG2-X)中p18的蛋白水平进行了比较。免疫印迹结果显示，与L-O2或HepG2相比，L-O2-X或HepG2-X细胞中p18蛋白的表达水平明显下调；反之，在L-O2-X或HepG2-X细胞中干扰HBx mRNA可导致p18的表达水平上调，表明HBx具有下调p18的作用。进一步在L-O2-X或HepG2-X细胞中干扰HULC，发现si-HULC可上调p18的表达水平，提示HBx通过上调HULC进而下调p18的表达。MTT检测结果显示，si-HULC可阻断HBx促进肝癌细胞增殖的能力，而且细胞增殖能力与上述p18的表达呈负相关。因此，HBx可通过上调HULC表达进而抑制p18表达促进肝癌细胞增殖的能力。
　　 综上所述，HBx可通过长非编码RNA HULC促进肝癌细胞增殖，与下调p18有关，进一步揭示了HBx致癌的分子机理，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 引言

第一节 肝癌和乙型肝炎病毒X蛋白

1.1.1 肝癌与乙型肝炎病毒

1.1.2 HBx蛋白及其功能

第二节 长非编码RNA和肝癌

1.2.1 长非编码RNA

1.2.2 长非编码RNA的功能

1.2.3 HULC与肝癌

第三节 研究目的和意义

第二章 实验材料和方法

第一节 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 细胞系

2.1.3 肝癌组织样本及来源

2.1.4 质粒

2.1.5 siRNA干扰片段

2.1.6 抗体来源

2.1.7 主要试剂

2.1.8 实验仪器

2.1.9 计算机软件

第二节 实验方法

2.2.1 细胞培养及传代

2.2.2 细胞株冻存

2.2.3 冻存细胞复苏

2.2.4 质粒的小量提取

2.2.5 质粒的纯化和定量

2.2.6 载体构建

2.2.7 基因转染

2.2.8 染色质免疫共沉淀

2.2.9 免疫印迹检测

2.2.10 Trizol法提取样本Total RNA及cDNA合成

2.2.11 实时定量PCR(Real-time PCR)

2.2.12 双荧光素酶报告基因检测

2.2.13 EdU检测细胞增殖

2.2.14 MTT检测细胞生长

2.2.15 平板克隆形成实验

2.2.16 动物体内成瘤实验

第三章 实验结果

3.1.1 HBx蛋白上调长非编码RNA HULC的表达水平

3.1.2 HBx通过与CREB直接结合激活HULC启动子表达

3.1.3 HULC在体外促进肝细胞和肝癌细胞增殖

3.1.4 HULC在动物体内促进肝癌细胞生长

3.1.5 HULC通过抑制抑癌基因p18的表达促进细胞增殖

3.1.6 HBx通过促进HULC表达进而抑制p18的表达增强细胞增殖能力

第四章 讨论

第五章 小结

参考文献

致谢

附录常规溶液配制

个人简历

在学期间论文发展情况