新型阳离子聚合物与脂质体用于基因与siRNA传递的研究

摘要

基因治疗为一些基因引起的疾病提供了潜在的治疗手段。基因载体方面，非病毒基因载体的安全性高、免疫原性低，越来越受到人们的重视，但相对病毒载体而言，非病毒载体的转染效率通常都不高，体内稳定性差等。针对非病毒载体转染效率低，体内稳定性差的问题，我们分别设计几种新型阳离子聚合物和脂质体作载体，用于高效的基因与siRNA的传递。论文的研究工作主要分为以下四部分：
　　 1.超分子自组装构建PEG化非病毒基因传递系统的研究
　　 为了解决PEI/DNA复合物在体内稳定性的问题，我们将双亲性PEG衍生物LD0-PEG通过疏水作用插入到PEI/DNA复合物内核，组装成超分子纳米颗粒复合物，以实现PEI/DNA复合物PEG化，从而提高其在体内应用的稳定性。粒径分析结果显示，在高盐和血清存在的情况下，PEI/LD0-PEG/DNA复合物具有较好的稳定性。对PEI/LD0-PEG/DNA复合物的表面电位进行测定，结果显示出其表面电位略低于PEI/DNA复合物，表明LD0-PEG能够屏蔽复合物表面的部分正电荷。体外转染实验显示，在血清存在的条件下，PEI/LD0-PEG/DNA复合物仍然能保持较高的稳定性。这表明，通过自组装的方法将PEI/DNA复合物进行PEG化，能够有效的提高其在血清中的稳定性，并且仍然维持较高的转染效率。
　　 2.以季戊四醇衍生物为核的树枝状高分子(PD-PAMAM)作为自杀基因载体的研究
　　 在基因治疗中，自杀基因引起了人们的注意，其中以聚酰胺胺类树枝状聚合物(PAMAM)作为载体的研究较少。我们先前合成了一种以季戊四醇衍生物为核的新型PAMAM(PD-PAMAM)，其中第五代的PD-PAMAM(G5 PD-PAMAM)是一种有效的基因载体。在此，我们以G5 PD-PAMAM为载体，用于携带自杀基因胞嘧啶脱氨酶(CD)的研究。琼脂糖凝胶电泳实验G5 PD-PAMAM能够与pCD-EGPF-N1结合形成复合物，DLS显示其粒径大小100 nm左右。体外实验显示复合物在人类肿瘤细胞系KB、HepG2和A549细胞中具有较好的转染效率。5FC敏感试验结果表明G5 PD-PAMAM介导的CD自杀基因转染，能够将低量的5氟胞嘧啶(5FC)转化为5氟尿嘧啶(5FU)，在很短的时间内诱导细胞死亡。与5FU相比，G5 PD-PAMAM介导的CD/5FC系统更能有效地引起细胞死亡。这些结果表明，G5 PD-PAMAM介导的自杀基因系统能够使CD基因在人源肿瘤细胞系内高效的表达。
　　 3.以季戊四醇衍生物为核的树枝状高分子(PD-PAMAM)作为siRNA载体的研究
　　 RNAi在疾病治疗中有着巨大的应用前景，但如何有效传递siRNA仍然是此研究中的瓶颈。在前期的实验基础上，我们选用G5 PD-PAMAM作为siRNA的载体，为siRNA的载体提供一种新的思路。琼脂糖凝胶电泳阻滞实验显示G5 PD-PAMAM与siRNA能够以较低的质量比(0.5:1)形成复合物，显示出G5PD-PAMAM与siRNA分子之间较强的复合能力。原子力显微镜显示复合物的粒径大小为40-70 nm。体外实验显示G5 PD-PAMAM/siRNA不存在细胞毒性，并能够有效的介导Luc-siRNA抑制荧光素酶的表达。通过细胞生物学的手段确定G5 PD-PAMAM/siRNA纳米复合物颗粒主要以通过clathrin(网格蛋白)介导的细胞内吞途径进入细胞。用分子信标(Molecular Beacon，MB)研究siRNA的释放，结果显示siRNA能够有效的从G5 PD-PAMAM中释放出来。
　　 4.脂肪胺构建的新型纳米脂质体作为siRNA载体的研究
　　 以脂质分子为基础的siRNA载体的研究不断有新的进展，如被称为lipidoids的新型类脂类材料。Avridine是一种具有免疫活性的脂肪胺类分子，目前已经用于制备脂质体，它还未被运用到传递siRNA的阳离子纳米载体的研究中。我们将Avridine与DOPE或Span80、和TPGS通过不同比例构建成新型的纳米载体(LANC)，测定了不同LANC的经粒径、电位和对siRNA的包封率，确定LANC-DOPE为合适的载体。体外转染结果显示，含5％ TPGS的LANC-DOPE能够有效介导Luc-siRNA抑制荧光素酶的表达。通过转染具有荧光标记的siRNA和MB研究细胞对LANCs/siRNA复合物的摄取和复合物对siRNA的释放。我们的研究为设计新型免疫脂质体作为siRNA载体提供了一种新的思路。
　　 综上所述，具有高效安全的基因载体需要在材料设计上取得突破。实验中，我们针对提高载体与基因或siRNA的相互作用、改善细胞相容性、增强细胞内吞机制等不同出发点，分别设计了几种不同类型的非病毒载体材料，结果表明，几种阳离子聚合物和脂质体均显示出较好基因与siRNA载体的性能，为今后非病毒基因与siRNA载体的研究提供了新的思路。