乙酸及NaCl和Na2CO3胁迫对莱茵衣藻的影响

摘要

目前，水体酸化已成为当今世界广为关注的环境问题之一，除无机酸外，有机酸也是引起环境酸化的重要原因，其中乙酸是有机酸的主要成分，广泛存在于自然界中，其含量可高达毫摩尔水平，对藻类植物的生长具有巨大的潜在威胁。除酸化外，干旱和半干旱地区的水体由于过度蒸发而存在不同程度的盐碱化，所以藻类植物还面临着盐碱化的影响。因此，鉴于酸化和盐碱化正日趋严重，日益影响着水域生态系统平衡与环境安全，本文以单细胞模式植物莱茵衣藻为实验材料，研究了乙酸、NaCl和Na2COH胁迫对其生长的影响、与光呼吸代谢的相互关系，同时对乙酸诱导莱茵衣藻发生PCD进行了深入研究，并测定了此过程中释放的VOCs，探讨了其信号作用，此外还就NaCl和Na2CO3胁迫诱导VOCs释放以及NaCl胁迫诱导光呼吸途径产生ROS进行了研究。结果如下：
　　 1.pH5.0乙酸、300mM NaCl以及25mM、50mM和150mM Na2CO3胁迫均会引起莱茵衣藻光合色素降解，并且此种降解作用与光照条件无关。除叶绿素降解外，乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫还使莱茵衣藻的光合特性发生改变，Fv/Fm、Y(Ⅱ)和ETR均发生了不同程度的降低；低强度胁迫使qP增强，而高强度胁迫则降低了qP；在一定时间内，所有胁迫处理均使NPQ增强。
　　 2.乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫均能诱导莱茵衣藻迅速产生大量的O2-和H2O2，当乙酸胁迫10min时，两种ROS含量均达到最大值；当NaCl和Na2CO3胁迫30min时，ROS含量达到最大值。在ROS含量升高的同时，细胞内SOD、POD和CAT活性也发生相应变化，其中低强度胁迫使这些酶的活性得到了不同程度的提高。
　　 3.莱茵衣藻在乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫处理后，对照株系CW-Arg及SGAT敲减株系T和A的SGAT酶活性均显著增强，Set和Gly含量升高，并且随NaCl胁迫强度增强，酶活性进一步增强、两种氨基酸含量进一步升高。虽然在正常以及乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫条件下，T和A株系的生长状况均弱于CW-Arg，但是在胁迫条件下，T和A株系受到的影响明显大于对照株系。这表明藻类植物的光呼吸途径与其抗逆性密切相关，逆境胁迫促进藻类植物的光呼吸途径运转，而光呼吸途径受阻后，藻类植物抵抗逆境胁迫的能力明显降低。
　　 4.采用抑制剂SHAM阻断乙醇酸-醌氧化还原酶系统或MOA阻断甘氨酸脱羧酶后，莱茵衣藻细胞内Ser含量明显降低，Gly含量明显升高，这表明其光呼吸途径的正常运转已受到明显影响。在NaCl胁迫条件下，经抑制剂处理的细胞所产生的ROS均明显少于未用抑制剂处理的细胞，其中SHAM处理后ROS含量最低，这表明SHAM阻断的反应即乙醇酸生成乙醛酸可能为光呼吸途径中ROS的产生位点。由于MOA处理阻断了甘氨酸向丝氨酸的转化，因此也影响了乙醇酸转化为乙醛酸，所以其ROS产量低于对照，但高于SHAM处理。采用NaCl胁迫SGAT敲减效果较强的A株系，由于丝氨酸向甘氨酸的转化被阻断，所以其ROS产生量也明显低于对照株系CW-Arg。这些结果表明，藻类植物的光呼吸途径也会导致ROS产生，其产生位点是叶绿体中乙醇酸经乙醇酸-醌氧化还原酶系统催化形成乙醛酸的反应。
　　 5.莱茵衣藻不能直接吸收利用外源L-Ser和L-Lys，而是通过胞外脱氨氧化的方式进行利用，并且此种脱氨过程依赖于氮饥饿，同时乙酸能促进此过程的进行。莱茵衣藻可利用L-Cys作为唯一氮源，其吸收量随胞外浓度增加或饲喂时间延长而增加，并且其被动扩散吸收过程不影响细胞对L-Leu的被动扩散吸收。
　　 6.pH5.0乙酸胁迫莱茵衣藻30min后，其DNA开始降解，在胁迫6h时DNA降解为150-350bp的片段。ZnSO4处理对此降解过程具有明显的抑制作用，并且1mM ZnSO4的抑制作用明显强于0.5mM。在pH5.0乙酸胁迫1h和2h时，分别有10％和95％的莱茵衣藻细胞内出现呈TUNEL阳性染色的细胞核，在胁迫4h时所有的细胞内均出现此细胞核，这表明pH5.0乙酸可诱导莱茵衣藻细胞发生PCD。
　　 7.乙酸(34.3mM)在pH5.0时可诱导莱茵衣藻细胞发生PCD，而H2SO4、HCl、H3PO4、磷酸缓冲液和乳酸在pH3.0时才能诱导细胞死亡，这表明溶液酸度不是诱导PCD的主要原因，而与乙酸自身的性质有关。当溶液中含有50mM乙酸，pH为6.0时，细胞死亡；然而当乙酸浓度增加至150mM，pH为7.0时，细胞则不死亡，在此情况下，溶液中的乙酸主要以乙酸根离子形式存在，因此，细胞死亡与溶液中的乙酸根离子浓度无关，而与溶液的pH值和乙酸分子浓度同时相关。
　　 8.在pH5.0乙酸诱导莱茵衣藻发生PCD的过程中，VOCs大量释放，其中在2h时释放量最大，并且成分最多，主要包括有烷烃类、烯烃类、醛类、醇类、酮类、酯类和萜烯类等34种化合物。此外，300mM NaCl和150mM Na2CO3胁迫莱茵衣藻2h也可诱导其释放大量的VOCs。乙酸和NaCl胁迫均可诱导己醛(GLVs)释放，其峰面积分别为23.49×107和3.14×107；而Na2CO3胁迫则不能诱导己醛释放，其诱导的特异性成分是3，4-二甲基-己烷和5-甲基-2-庚烯。长叶烯是此三种胁迫诱导释放的主要萜烯类化合物，其峰面积分别为5.82×107(乙酸)、3.11×107(NaCl)和4.00×107(Na2CO3)。
　　 9.将乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫诱导的莱茵衣藻VOCs通入正常生长的莱茵衣藻溶液中，其细胞生长受到明显抑制，而其叶绿素含量、Fv/Fm、H2O2含量和抗氧化酶活性均不同程度增加，这表明非生物胁迫诱导的VOCs可能具有在藻类植物间进行信息传递的作用。