结肠癌候选糖蛋白生物标志物的鉴定及验证和新型娃儿藤碱衍生物NK-007在肠炎模型中的作用及机制探讨

摘要

结肠癌是一个重要的世界性的公共卫生问题，新的肿瘤生物标志物将有助于提高结肠癌病人在疾病的早期发现、预后或监视。本研究主要是评估结肠癌患者组织的糖蛋白质谱，以期发现潜在的糖蛋白生物标志物。首先使用凝集素芯片比较结肠癌组织和对应的正常组织蛋白之间糖链表达谱。结果表明与正常组织相比，结肠癌组织中有着广泛的糖基化的表达，并且糖基化的强度较高。为了验证芯片的结果，使用了凝集素组织化学的方法。结果发现马铃薯凝集素(STL)所结合的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的水平在结肠癌中升高，这与凝集素芯片的结果一致。为了进一步探究N-乙酰氨基葡萄糖所结合的糖蛋白究竟是何种，首先使用凝集素亲和的方法，利用磁珠为载体分离富集能与凝集素STL特异性结合的糖蛋白/糖肽，洗脱后用于液相色谱和质谱进行蛋白的分析和鉴定。通过蛋白质组学定量分析，确定了72个具有高可信度的蛋白质。这些蛋白质当中，有17个特异性的在结肠癌组织中检测到，14个蛋白在肿瘤组织中显著上调。随后，选取两个仅在癌组织中表达或在癌组织中上调的蛋白进行进一步的验证，它们分别为AnnexinA1和HSP90β。首先通过免疫沉淀加上凝集素印迹的方法用于验证Annexin A1和HSP90β是否是N-乙酰氨基葡萄糖化的，以及它们的糖基化水平在结肠癌和癌旁组织中的表达情况。结果证实这两个蛋白都是N-乙酰氨基葡萄糖化的，并且糖基化的水平在结肠癌组织中有着较高的表达，这与质谱的结果一致。随后利用免疫印迹和免疫组化的方法进一步确定Annexin A1和HSP90β其本身在结肠癌和癌旁的表达情况。结果显示与正常组织相比，Annexin A1和HSP90β自身的蛋白表达水平在结肠癌中也较高。结论是，Annexin A1和HSP90β其自身的蛋白表达水平以及N-乙酰氨基葡萄糖化的水平在结肠癌中都有着过高的表达，其肿瘤特异性的糖链模式可以作为区分结肠癌癌症患者与健康人的候选生物标志物。
　　肠炎相关癌症(CAC)是结肠癌的一种类型，在临床检测时伴有炎症性肠病(IBD)。研究表明IBD是诱发CAC的因素之一，能够有效地预防和治疗IBD成为预防肠癌的有效手段之一。在这项研究中，合成（±）-tylophorine malate(NK-007)，tylophorine(DCB3503)衍生物，并探讨了它在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型和乙酸诱导肠炎模型中的体内抗炎效果。根据疾病活动指数(DAI)和大体肠损伤程度参数，结果显示NK-007可以显著抑制肠炎。为了探讨NK-007的作用机制，研究了NK-007对由LPS刺激的小鼠骨髓来源的细胞以及单核细胞/巨噬细胞株RAW264.7中肿瘤坏死因子-α产生的影响。对于这两种类型的天然免疫细胞，NK-007表现出有效的抑制TNF-α的效果，另外还降低了IL-12在BMDCs中的表达。此外，NK-007处理的Raw264.7细胞还可以降低NF-κB的磷酸化，这有可能解释了NK-007在实验性肠炎中的保护性免疫调节作用。