细胞外钙浓度和流体剪切力对成骨细胞的影响及作用机制

摘要

在骨的形成过程中，成骨细胞胞外钙离子浓度([Ca2+]o)会有所升高（从2mM升高至8～40 mM），外钙浓度上升直接抑制破骨细胞的活性，刺激成骨细胞活性。有报道称，细胞外钙离子浓度升高会促进成骨细胞的增殖，但是[Ca2+]o升高对成骨细胞的刺激机制目前尚未明了。在本研究中，我们发现[Ca2+]o升高引发成骨细胞SOCE(Store operated calcium entry)机制，并对细胞增殖有着促进作用。首先我们发现升高[Ca2+]o可以引起细胞内钙离子浓度[Ca2+]i上升，这种[Ca2+]i上升主要是由于细胞外钙内流引起的。SOCE机制的阻断剂2-APB与细胞内钙释放抑制剂TMB-8都能抑制这种现象，而电压门控的钙离子通道(Cav)抑制剂硝苯地平(nifedipine)和维拉帕米（verapamil）都不能抑制该现象。NPS2390和U73122能抑制这种[Ca2+]i上升，NPS2390是钙敏感的受体通道(CaSR)的特异性抑制剂，U73122是磷脂酶C(PLC)的抑制剂。我们同样发现[Ca2+]o升高对成骨细胞增殖的促进作用，增殖被2-APB，TMB-8，NPS2390和U73122抑制，不受nifedipine和verapamil的影响。此外，GdCl3是一种非生理性的CaSR的激动极，可以引起[Ca2+]i的升高及细胞增殖。以上结果显示，成骨细胞[Ca2+]o上升活化CaSR，并激活PLC，引起细胞增殖。
　　 人体的骨关节系统一直处于受力状态，成骨细胞是骨关节系统形成的源动力，也是骨关节系统中力学信号感受与响应的的关键细胞群，机械力刺激对成骨细胞的生长增值、分化分泌、细胞骨架重组等多种生理功能有显著影响，不过，关于力学因素调节成骨细胞功能的详细机制尚未阐明。在本文中，我们发现流体剪切力(Fluid Shear Stress，FSS)可以刺激成骨细胞引起细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）上升，并且诱导细胞向外分泌ATP，这种作用很可能是通过TRPV4通道的活化来实现的。首先，我们证明了TRPV4通道基因在成骨细胞中的表达。然后，我们采用0.12 Pa、0.24 Pa、0.48 Pa和1.2 Pa的FSS来刺激成骨细胞，[Ca2+]i及细胞外液中的ATP浓度都随之升高，其中GdCl3、钌红（RR）和EGTA都能抑制细胞分泌ATP，GdCl3是机械敏感离子通道MSCC(mechanosensitivecation-selective channel)的阻断剂、辽红(Ruthenium Red，RR)是香草素受体偶联的离子通道(TRPV)类阻断剂、EGTA是细胞外钙离子的鳌合剂。此外，4α-PDD是TRPV4通道特异性激动剂，它能刺激细胞分泌ATP，且ATP的分泌受GdCl3、RR和EGTA的抑制。除了4α-PDD，另一组对照实验中，我们发现低渗透压的细胞外液同样能使成骨细胞分泌ATP。通过以上结果，我们得出结论:剪切力FSS可以刺激成骨细胞引起细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）上升，并且诱导细胞向外分泌ATP，这种作用很可能是通过TRPV4通道的活化来实现的。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 成骨细胞及骨组织

1．1．1 骨组织

1．1．2 成骨细胞简介

1．1．3 成骨细胞在骨形成中的作用

1．1．4 骨形成及代谢过程中影响成骨细胞的因素

第二节 细胞外钙对成骨细胞的影响

1．2．1 细胞外钙与成骨细胞的关系

1．2．2 成骨细胞与钙信号

1．2．3 成骨细胞中的SOCE

1．2．4 钙敏感受体CaSR(Calcium-Sensing Receptors)

1．2．5 成骨细胞中其他钙信号机制

第三节 流体剪切力对成骨细胞的影响

1．3．1 骨组织的结构特征

1．3．2 TRPV4通道

1．3．3 力学刺激在成骨胞内的转导机制

第四节 研究目的和研究内容

1．4．1 研究目的

1．4．2 研究内容

第二章 实验材料与方法

第一节 流体剪切力装置-流室

2．1．1 流室的设计原理

2．1．2 自制流室与微流控芯片

第二节 实验材料与实验设备

2．2．1 实验材料

2．2．2 主要试剂及来源

2．2．3 仪器设备

第三节 药物与溶液的配制

2．3．1 各种缓冲液

2．3．2 培养基

2．3．3 其他药物和试剂

第四节 实验技术和方法

2．4．1 成骨细胞的提取

2．4．2 成骨细胞的传代与培养

2．4．3 MTT比色法检测细胞增殖

2．4．4 成骨细胞[Ca2+]i的检测

2．4．5 细胞外ATP的检测方法

第五节 数据处理

第三章 实验结果

第一节 细胞外钙对成骨细胞增殖的影响和作用机制

3．1．1 细胞外钙([Ca2+]o)升高引起成骨细胞内钙([Ca2+]o)上升

3．1．2 SOCE机制在[Ca2+]o引起的[Ca2+]i上升中起着关键的作用

3．1．3 电压依赖的钙离子通道(Cav)与[Ca2+]o引起的[Ca2+]i上升无关

3．1．4 [Ca2+]o引起的SOCE机制依赖于CaSR的活化

3．1．5 [Ca2+]o引起的成骨细胞增殖机理

第二节 流体剪切力(FSS)对成骨细胞的刺激机理

3．2．1 TRPV4通道在成骨细胞中的表达

3．2．2 FSS对成骨细胞的作用

3．2．3 FSS对成骨细胞内钙离子浓度[Ca2+]i的影响

3．2．4 FSS对成骨细胞ATP分泌及分泌量的影响

3．2．5 阻断剂对FSS引起的ATP分泌的影响

3．2．6 4α-PDD对成骨细胞ATP分泌的影响

3．2．7 低渗透压作用对成骨细胞的作用

第四章 分析与讨论

第一节 实验结果分析

4．1．1 实验结果总结

4．1．2 含钙与不含钙离子的HBSS缓冲液在[Ca2+]o引起[Ca2+]i升高实验中的区别

4．1．3 FSS刺激过程中ATP释放与钙信号的产生

4．1．4 GdCl3对同一种细胞既作为激动剂又作为抑制剂

第二节 本文的不足及进一步的工作

参考文献

致谢

个人简历