温敏性复合胶束对蛋白酶的辅助复性作用

摘要

酶在生物催化剂领域有着广泛的应用，对于人类的科学研究和工业生产有着重要的意义，然而许多酶在生产过程中容易发生错误折叠而失去活性，这大大降低了酶的生产效率和工业应用。本文提出了一种利用复合胶束模拟分子伴侣来辅助蛋白酶复性的方法。我们制备了三种由不同比例的嵌段共聚物聚乳酸-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PLA-b-PNIPAM）与聚乳酸-b-聚乙二醇(PLA-b-PEG)组成的温敏性的复合胶束(mixed-shell polymeric micelles，MSPMs)，通过动态光散射考察了复合胶束在37℃以及在变性剂存在下的稳定性。以碳酸酐酶(CAB)和脂肪酶(Lipase)作为模型蛋白，研究了MSPM辅助蛋白质折叠的能力。结果表明，在高浓度变性剂存在下，PNIPAM仍具有温敏性，并且质量比为1∶1的PLA-b-PNIPAM和PLA-b-PEG制备的MSPM具有非常好的稳定性。不同比例的MSPM对于CAB和Lipase都具有辅助复性效果，远远高于没有MSPM时的自发复性。其中，质量比为1∶1的MSPM使CAB的复性率高达92.1％，Lipase的复性率也达到50％。
　　随着基因工程和蛋白质工程的发展，人们利用大肠杆菌的特性，可以大量生产目的蛋白，但是由于大肠杆菌细胞自身的机制，所得到的产物通常为包涵体，即蛋白质的聚集体，没有生物活性。基于前面的研究，我们期望通过该复合胶束，或者在此复合胶束的基础上做一些修饰，以辅助包涵体蛋白的复性。人亲环素33(hCyP33)是一种在人T细胞核内被发现的亲环素类蛋白，在新生肽链的折叠和生物大分子的组装过程中起关键作用。在此部分中我们在大肠杆菌中成功达了hCyP33蛋白，提取了hCyP33蛋白的包涵体，经过洗脱和溶解后，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实，我们已得到较为纯净的目的蛋白，为下步应用复合胶束辅助该蛋白复性的研究工作奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第一节 酶的结构及其变性过程

1．1．1 酶的结构

1．1．2 酶的变性过程

1．1．3 应用价值

第二节 亲环素33蛋白质

1．2．1 免疫抑制剂

1．2．2 亲免蛋白家族

1．2．3 亲免蛋白的肽脯氨酰顺反异构酶活性

1．2．4 亲环素33

第三节 环境敏感性聚合物

第四节 辅助酶复性的方法

1．4．1 透析复性

1．4．2 辅助因子

1．4．3 人工分子伴侣

第五节 选题的目的和意义

第二章 实验部分

第一节 复合胶束辅助蛋白酶复性

2．1．1 主要试剂及材料

2．1．2 主要仪器

2．1．3 PLA-b-PEG与PLA-b-PNIPAM复合胶束的制备

2．1．4 光散射样品的制备

2．1．5 电镜样品的制备

2．1．6 复性缓冲溶液的制备

2．1．7 PNIPAM在变性剂中的LCST测试

2．1．8 酶的复性过程以及活性测试

第二节 包涵体蛋白的表达与提取

2．2．1 主要试剂与材料

2．2．2 主要实验仪器

2．2．3 细菌培养

2．2．4 融合蛋白质的大量表达以及包涵体的提取

2．2．5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

第三章 结果与讨论

第一节 复合胶束的表征

3．1．1 在变性剂中PNIPAM的LCST表征

3．1．2 光散射表征

3．1．3 电镜表征

3．1．4 温敏性复合胶束在变性剂中的稳定性

第二节 复合胶束辅助CAB和Lipase的复性效果研究

3．2．1 紫外检测复合胶束对碳酸酐酶CAB的复性效果

3．2．2 紫外检测复合胶束对脂肪酶Lipase的复性效果

3．2．3 圆二色谱表征蛋白酶的复性效果

第三节 包涵体蛋白的表达与提取

3．3．1 SDS-PAGE对包涵体蛋白的表征

第四章 全文总结

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果