前列腺癌中废除KLF5的乙酰化修饰将其由抑癌基因转变为促癌基因

摘要

前列腺癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤，并且容易发生浸润和迁移。在不同的国家和地区，前列腺癌的发病率存在差异，在欧美发达国家和地区，前列腺癌具有非常高的发病率，也是男性恶性肿瘤主要致死原因之一;在我国，前列腺癌的发病率和致死率低于欧美发达国家，但是随着近年来人口老龄化的加剧以及饮食习惯的改变，我国男性前列腺癌的发病率呈现不断上升的趋势。为了提高前列腺癌的治疗效果以及患者的生活质量，许多前列腺癌相关基因的功能及分子机制有待研究。
　　作为基础转录因子，KLF5（Kruppel-like factor5）同时具有肿瘤抑制功能和肿瘤促进功能，尽管这种功能转换的机制尚不明确。我们以前的研究结果表明，在正常上皮细胞中，KLF5促进细胞增殖，而经过TGF-β处理之后，KLF5抑制细胞增殖，这是因为TGF-β可以招募p300诱导KLF5的乙酰化，进而改变KLF5转录复合体以及下游靶基因p15和MYC的表达，从而将KLF5的功能由促进细胞增殖转变为抑制细胞增殖。
　　在这篇文章中，我们检测了KLF5的乙酰化修饰形式是否决定了其在肿瘤发生过程中的相反作用。首先，我们选用前列腺癌细胞系DU145和PC-3为细胞模型，这两种细胞的均低表达KLF5，并且它们的增殖均受到TGF-β的抑制。在这两种细胞系中，我们通过病毒感染的方法构建稳定表达野生型KLF5以及KLF5突变体K369R的克隆，K369R突变体可以组成型废除KLF5的乙酰化修饰。体外细胞培养的研究结果表明，野生型KLF5阻抑细胞增殖，抑制MYC表达，促进p15表达，而K369R突变体丧失阻抑细胞增殖的功能，促进MYC表达。这些研究结果提示我们，KLF5抑制细胞增殖的功能依赖于其自身的乙酰化修饰。
　　接下来，我们用上述稳定克隆进行动物实验，同样的，KLF5在乙酰化的状态下抑制肿瘤生长，而去乙酰化的K369R突变体可以将KLF5的功能转变为促进肿瘤生长。随后，我们在裸鼠体内注射TGF-β抑制剂SB431542，结果表明，封闭TGF-β信号通路可以废除KLF5的抑癌功能。
　　最后，我们将空载对照pLHCX、野生型KLF5以及K369R突变体的成瘤样本送RNA-Seq检测，结果表明，AcKLF5和unAcKLF5分别调控不同的下游靶基因，以不同的方式影响不同的生物学过程，从而决定二者在肿瘤发生发展过程中的相反功能。
　　综上所述，KLF5的乙酰化形式可以通过调控MYC和p15以及相关下游基因表达的方式抑制前列腺癌的细胞增殖和肿瘤生长，废除KLF5的乙酰化修饰将KLF5的抑癌功能转变为促癌功能。这些结果为研究KLF5由抑癌功能转变为促癌功能的机制提供了新的视野，同时也支持AcKLF5和unAcKLF5在TGF-β的抑癌功能和促癌功能的转换中发挥作用。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 引言

第一节 前列腺癌简介

1．1．1 前列腺的结构

1．1．2 前列腺的功能

1．1．3 前列腺癌的发生和发展

1．1．4 前列腺癌的发病机制

1．1．5 前列腺癌的分级和分期

1．1．6 前列腺癌的治疗

第二节 KLF5基因简介

1．2．1 KLF5的结构

1．2．2 KLF5蛋白的翻译后修饰

1．2．3 KLF5的表达

1．2．4 KLF5调控的下游靶基因

1．2．5 KLF5相互作用蛋白

1．2．6 KLF5参与的信号通路

1．2．7 KLF5既具有促癌功能又具有抑癌功能

第三节 TGF-β简介

1．3．1 TGF-β信号通路

1．3．2 TGF-β具有抑癌基因的功能

1．3．3 TGF-β具有促癌基因的功能

1．3．4 TGF-β与前列腺癌的关系

1．3．5 TGF-β和KLF5的关系

第二章 研究目标与意义

第一节 研究目标

第二节 研究意义

第三章 材料与方法

第一节 实验材料

3．1．1 细胞系

3．1．2 主要试剂、耗材及试剂盒

3．1．3 质粒

3．1．4 引物

3．1．5 抗体

3．1．6 干扰RNA(SiRNA)

3．1．7 小鼠

第二节 实验方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 质粒转染

3．2．3 质粒构建(本实验采用亚克隆的方法构建质粒)

3．2．4 病毒包装

3．2．5 病毒感染

3．2．6 转基因多克隆细胞系筛选

3．2．7 SiRNA敲减实验

3．2．8 细胞增殖检测

3．2．9 细胞免疫荧光染色(immunofluorescence，IF)

3．2．10 RNA提取

3．2．11 Western blotting

3．2．12 裸鼠成瘤实验

3．2．13 RNA-Seq检测

3．2．14 统计分析

第四章 实验结果

第一节 TGF-β抑制前列腺癌细胞系的增殖

4．1．1 TGF-β抑制前列腺癌细胞系的增殖

4．1．2 SB431542可以封闭TGF-β信号通路

4．1．3 SB431542可以废除TGF-β对细胞增殖的抑制

第二节 TGF-β通过KLF5抑制前列腺癌细胞增殖

第三节 TGF-β抑制前列腺癌细胞系增殖的分子机制

3．1．1 TGF-β通过AcKLF5调控p15和MYC抑制细胞增殖

3．1．2 SB431542可以废除TGF-β介导的KLF5乙酰化以及下游基因调控

第四节 乙酰化修饰是KLF5在前列腺癌中抑制细胞增殖所必需的

第五节 乙酰化的不足可以将KLF5由肿瘤抑制基因转变为肿瘤促进基因

第六节 封闭掉TGF-β信号减弱KLF5的肿瘤抑制基因功能

第七节 AcKLF5和unAcKLF5行使不同功能的机制研究

第八节 小结

第五章 讨论

第六章 结论与展望

第一节 结论

6．1．1 乙酰化修饰是KLF5在前列腺癌中抑制细胞增殖所必需的

6．1．2 乙酰化的不足可以将KLF5由肿瘤抑制基因转变为肿瘤促进基因

6．1．3 封闭掉TGF-β信号减弱KLF5的肿瘤抑制基因功能

第二节 展望

附录

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的论文与研究成果