脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白NMB0315的晶体结构研究

摘要

脑膜炎奈瑟球菌是一种时常附着在人类鼻咽部的共生菌，同时也是引起脑膜炎的主要原因。全球性脑膜炎的爆发非常危险，在一些国家中，死亡率有时会达到10％。由于脑膜炎病情发展迅速，提前的预防治疗变得非常重要，这使得研究者将大量精力放在脑膜炎疫苗的开发上。脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白常与细菌毒性相关，由于其时常暴露于细胞外膜上，也使之成为脑膜炎疫苗研发的潜在依据。为此，一大批脑膜炎球菌的外膜蛋白被发现和研究，其中就包括了NMB0315蛋白。
　　NMB0315是一种B群脑膜炎球菌的外膜蛋白，尽管关于其功能的研究较少，但是通过序列的相似性比较，发现它是一种lysostaphin类肽酶，属于M23金属肽酶超家族。这个家族的蛋白成员被认为是锌离子依赖的肽酶，具有水解富含甘氨酸的多肽的功能。它们常存在于各种革兰氏阳性及阴性细菌中，依靠其肽酶的活性，参与到细胞生长、分裂以及一些细菌毒性相关的生理活动中。到目前为止，通过晶体学的手段，研究者们已经获得了一些lysostaphin类蛋白的三维结构。尽管它们在锌离子结合的活性位点上相对保守，但是其整体结构上的差异，还是让人们对于它们在不同细菌中的功能意义产生疑问。同时，一些lysostaphin类蛋白被认为是以非活性的酶原状态被表达出来，需要进一步的加工才能获得活性。
　　本研究表达、纯化了NMB0315蛋白，并通过X射线晶体学方法解析了它的三维结构。NMB0315的整体结构中包含三个结构域，其中第三个结构域为其催化结构域;同时研究还观察到了一个金属离子结合的催化核心，其结构在M23家族中非常保守，并证明了其中结合的金属离子是锌离子。另外，研究发现全长的NMB0315是处于一种自抑制的状态，其自抑制的方式有别于其它lysostaphin类蛋白。本研究为探索M23家族金属肽酶的结构和功能提供了依据，并为NMB0315在脑膜炎奈瑟球菌中的功能研究奠定了结构基础。
　　此外，本文中还表达并纯化了内置网上的钙离子感受器STIM1蛋白的CC1+SOAR结构域，并尝试通过人为的改造来模拟CRAC通道(Ca2+releaseactivated Ca2+ Channel)开放后的STIM1分子。这些工作为未来激活态STIM1分子的结构生物学研究提供了新的思路和方法。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 脑膜炎和脑膜炎奈瑟球菌

第二节 Lysostaphin与M23超家族

第三节 M23金属肽酶家族的结构生物学研究进展

第二章 材料和方法

第一节 实验材料

2．1．1 目的基因

2．1．2 常用载体

2．1．3 本文所用大肠杆菌菌株

2．1．4 试剂与耗材

2．1．5 实验用仪器及工具

2．1．6 实验试剂及溶液配制

2．1．7 纯化用缓冲液配制

第二节 实验方法

2．2．1 基因克隆及质粒构建

2．2．2 目的蛋白的小量表达测试

2．2．3 目的蛋白的大量表达

2．2．4 目的蛋白的纯化

2．2．5 目的蛋白质的结晶

2．2．6 晶体衍射数据的收集

2．2．7 晶体结构的解析

2．2．8 等温滴定量热法

2．2．9 原子吸收光谱分析

2．2．10 分子间交联实验

第三章 NMB0315的表达、纯化和晶体学研究

第一节 全长NMB0315的表达、纯化和结晶

3．1．1 NMB0315的小量表达

3．1．2 NMB0315的大量表达及纯化

3．1．3 NMB0315的晶体初筛及初步优化

3．1．4 利用其它方法优化全长NMB0315晶体

第二节 NMB0315(61-420)的表达、纯化与结晶

3．2．1 NMB0315的二级结构预测和截短分析

3．2．2 0315F1的质粒构建及小量表达测试

3．2．3 0315F1的大量表达及纯化

3．2．4 0315F1的晶体生长

第三节 NMB0315(54-420)的表达、纯化与结晶

3．3．1 胰蛋白酶消化实验

3．3．2 NMB0315两种片段的小量表达测试

3．3．3 0315F3的大量表达及纯化

3．3．4 0315F3结晶条件的初筛

3．3．5 0315F3的甲基化及结晶初筛

3．3．6 0315F3片段的晶体优化

第四节 NMB0315的结构解析

3．4．1 NMB0315晶体衍射数据的处理

3．4．2 初始相位的计算

3．4．3 相位的获得和初始模型的搭建

3．4．4 野生型数据的代入

3．4．5 NMB0315结构的修正

第五节 NMB0315的结构及功能分析

3．5．1 NMB0315的整体结构

3．5．2 NMB0315的活性位点

3．5．3 NMB0315活性位点中金属离子的研究

3．5．4 NMB0315与其他M23家族蛋白的结构对比

3．5．5 NMB0315的自抑制机制

第六节 NMB0315活性的初步探索

3．6．1 NMB0315 DomaimⅢ的纯化尝试

3．6．2 DomainⅡ+DomainⅢ的纯化及活性研究

3．6．2 结果分析

第七节 讨论与总结

第四章 STIM1结构生物学的初步研究

第一节 引言

4．1．1 钙离子信号转导

4．1．2 钙库操纵的钙内流

4．1．3 Orai1和STIM1分子

第二节 STIM1 C端部分片段的GST融合蛋白的研究

4．2．1 hSTIM1(254-483)GST融合蛋白的表达与纯化

4．2．2 hSTIM1(246-489)GST融合蛋白的表达、纯化与晶体初筛

4．2．3 ceSTIM1(212-410)GST融合蛋白的表达、纯化与晶体初筛

第三节 利用N端交联模拟STIM1激活态的尝试

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历