DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂以依赖LXR的方式诱导巨噬细胞ABCA1表达及胆固醇外输

摘要

动脉粥样硬化斑块的形成是心血管疾病的主要病理之一。富集大量胆固醇和脂质的巨噬细胞（亦称为泡沫细胞）是动脉粥样硬化斑块的重要组成成分。因此，维持巨噬细胞内胆固醇的动态平衡对于阻止动脉粥样硬化斑块及心血管疾病的发生发展至关重要。胆固醇逆转运是体内胆固醇代谢的重要过程，能有效地防止冠心病的发生。
　　ATP结合盒转运蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）对心血管系统的保护作用已在人类和动物模型中得到验证。ABCA1利用ATP水解能量，主动、单向地将自由胆固醇和磷脂从巨噬细胞内运输到细胞外胆固醇接收提，是胆固醇外流与逆向转运过程的关键第一步，对初生态HDL的形成及其代谢过程中起着至关重要的作用。细胞中ABCA1的水平主要通过转录来调节，特别是通过配体激活的肝X受体，LXR（一种重要的转录因子）。
　　Teniposide和etoposide是目前已上市的两种DNA拓扑异构酶Ⅱ的抑制剂。两者的作用机制类似，均促使酶-DNA断裂复合物的形成，使平衡反应趋向于酶-DNA断裂复合物，延长其半衰期并使其稳定。可断裂复合物的形成及稳定存在促进了DNA的异常重组，从而启动细胞凋亡程序而导致细胞死亡，因此，此类抑制剂临床上可应用与肿瘤肿瘤。DNA拓扑异构酶Ⅱ与其抑制剂在肿瘤学和免疫学得到深入的研究，但是否在其他领域发挥功能尚不清晰。有报道发现etoposide可以显著减缓兔中动脉硬化进程，但其机理不明，我们认为DNA拓扑异构酶Ⅱ的抑制剂可通过调节巨噬细胞胆固醇外流及相关分子的表达，从而抑制巨噬细胞泡沫化并发挥抗动脉粥样硬化功能。在此文中，我们通过实验证实DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂teniposide和etoposide可以有效地诱导巨噬细胞自由胆固醇外流，这种诱导作用与巨噬细胞ABCA1 mRNA和蛋白上调相一致。teniposide和etoposide可以诱导ABCA1启动子活性，这种诱导作用与ABCA1启动子上的LXRE密切相关，是以依赖LXR的方式上调ABCA1启动子活性。同时EMSA实验结果证实，teniposide和etoposide有效增强了LXRE-LXR/RXR复合体的形成。启动子实验及EMSA实验结果证明teniposide和etoposide在转录水平上以LXR依赖的方式诱导ABCA1表达。同时，我们也证实了teniposide和etoposide可以诱导其它LXR靶基因ABCG1和FASN的表达。体内实验证明teniposide和etoposide可以有效地诱导体内胆固醇由巨噬细胞向体外的逆转运。
　　在本文中，我们还发现另外一类抗肿瘤药物MEK1/2抑制剂PD98059和U0126亦可以很好地诱导体外和体内巨噬细胞ABCG1的表达和体内胆固醇外流。U0126亦可以很好地诱导动脉粥样硬化斑块处巨噬细胞中ABCG1的表达。
　　综上所述，我们的研究结果证实teniposide和etoposide及其他抗肿瘤药物可以诱导巨噬细胞胆固醇外流分子的表达及胆固醇外输，抑制巨噬细胞内胆固醇的积累，细胞泡沫化与动脉粥样硬化的发展。我们的工作一方面揭示了抗肿瘤药物的新功能，另一方面为这类药物潜在的新功能发挥提供了理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 引言

第一节 巨噬细胞与动脉粥样硬化

1．1．1 单核细胞粘附与激活

1．1．2 泡沫细胞形成

1．1．3 泡沫细胞增殖与凋亡

1．1．4 动脉粥样硬化斑块稳定性

第二节 ATP结合盒转运蛋白A1、G1与动脉粥样硬化

1．2．1 ABCA1的结构、分布与功能

1．2．2 ABCG1的结构、分布与功能

1．2．3 ABCA1、ABCG1的调控

1．2．4 ABCA1、ABCG1与动脉粥样硬化

第三节 DNA拓扑异构酶Ⅱ与动脉粥样硬化

1．3．1 DNA拓扑异构酶Ⅱ

第四节 MEK1／2抑制剂与动脉粥样硬化

1．4．1 细胞外信号调节激酶1／2

第五节 选题依据

2．5．1 选题背景

2．5．2 课题提出

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料与试剂

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

第二节 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 Western blot检测ABCA1、LXRs、ABCG1、RIP140和FAS

2．2．3 Northern blot与Realtime RT-PCR

2．2．4 ABCG1启动子质粒的构建

2．2．5 凝胶阻滞分析(Gel Shift Assay System／electrophoretic mobility shiftassay，EMSA)

2．2．6 LXR表达载体构建

2．2．7 体外胆固醇外流实验

2．2．8 体内胆固醇外流实验

2．2．9 细胞免疫荧光染色

2．2．10 主动脉冰冻切片制作及荧光染色

2．2．11 siLXR的合成和干扰实验

第三章 结果与分析

第一节 DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂teniposide及etoposide诱导巨噬细胞体外胆固醇外输

第二节 DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂teniposide及etoposide诱导巨噬细胞ABCA1的表达

3．2．1 Teniposide及etoposide诱导巨噬细胞系RAW264．7ABCA1的表达

3．2．2 Teniposide及etoposide诱导原代巨噬细胞ABCA1的表达

3．2．3 Teniposide及etoposide诱导巨噬细胞ABCA1 mRNA表达

3．2．4 Teniposide及etoposide诱导巨噬细胞ABCA1的膜表达

3．2．5 Teniposide及etoposide诱导人源巨噬细胞ABCA1的表达

第三节 Teniposide诱导巨噬细胞ABCA1 mRNA的表达是依赖LXR信号通路的

3．3．1 Teniposide对于ABCA1 mRNA的诱导是通过LXR途径

第四节 DNA拓扑异构酶抑制剂teniposide及etoposide通过LXR诱导ABCA1启动子活性

3．4．1 ABCA1启动子活性分析

3．4．2 外源性LXRα及LXRβ增强DNA拓扑异构酶抑制剂对于ABCA1启动子活性的诱导

3．4．3 LXR／RXR增强了ABCA1启动子活性

3．4．4 Teniposide及etoposide诱导ABCA1启动子活性依赖于LXRE

第五节 Teniposide及etoposide激活核受体LXRs

3．5．1 Teniposide及etoposide诱导巨噬细胞核中LXRs表达上调

3．5．2 Teniposide和etoposide促进了LXR／RXR-DR4复合体的形成

3．5．3 Teniposide及etoposide可以与人LXRβ配体结合区域相结合

3．5．4 9-cis-RA与teniposide及etoposide协同诱导巨噬细胞中ABCA1的表达

3．5．5 Teniposide抑制巨噬细胞中LXR共抑制因子RIP140的表达

第六节 Teniposide及etoposide诱导LXR其他靶基因的表达

3．6．1 Teniposide及etoposide诱导LXR靶基因ABCG1的表达

3．6．2 Teniposide及etoposide诱导LXR靶基因FASN的表达

第七节 Teniposide及etoposide诱导体内巨噬细胞中ABCA1的表达，并促进了体内胆固醇逆转运

3．7．1 Teniposide及etoposide诱导体内巨噬细胞ABCA1的表达

3．7．2 Teniposide及etoposide诱导小鼠体内胆固醇的逆转运

第八节 MEK1／2抑制剂PD98059及U0126诱导巨噬细胞ABCG1蛋白的表达

3．8．1 MEK1／2抑制剂PD98059及U0126诱导巨噬细胞系RAW264．7中ABCG1的表达

3．8．2 MEK1／2抑制剂PD98059及U0126诱导原代巨噬细胞ABCG1的表达

第九节 MEK1／2抑制剂PD98059及U0126转录水平上调控ABCG1的表达

3．9．1 MEK1／2抑制剂PD98059及U0126诱导巨噬细胞ABCG1 mRNA的表达

3．9．2 MEK1／2抑制剂PD98059及U0126诱导小鼠体内巨噬细胞ABCG1 mRNA的表达

3．9．3 MEK1／2抑制剂PD98059及U0126诱导ABCG1启动子活性

3．9．4 RXR与MEK1／2转录水平上对于ABCG1表达的影响

第十节 MEK1／2抑制剂对于LXR表达及核转运的影响

3．10．1 MEK1／2抑制剂诱导巨噬细胞LXRcα的表达和入核

第十一节 MEK1／2抑制剂体内功能研究

3．11．1 ERK1／2抑制剂U0126对于小鼠体内胆固醇外输的影响

3．11．2 U0126诱导小鼠体内动脉粥样硬化斑块巨噬细胞ABCG1的表达

第四章 讨论

第一节 Topo Ⅱ抑制剂通过诱导巨噬细胞ABCA1表达来促进体外和体内胆固醇逆转运

4．1．1 Topo Ⅱ抑制剂诱导巨噬细胞体外和体内胆固醇逆转运

4．1．2 Topo Ⅱ抑制剂对于胆固醇逆转运的诱导作用归结于ABCA1蛋白的上调

第二节 Topo Ⅱ抑制剂对于巨噬细胞ABCA1表达的调控发生在转录水平

第三节 Topo Ⅱ抑制剂诱导LXR的活化

4．2．1 Topo Ⅱ抑制剂诱导LXR表达和入核

4．2．2 Topo Ⅱ抑制剂模拟与人LXRβ配体结合区域的结合

4．2．3 Topo Ⅱ抑制剂与LXR／RXR的作用

第四节 Topo Ⅱ对于LXR其他靶基因的效果

第五节 MEK1／2抑制剂与ABCG1的关系

第六节 后续工作

结论

论文创新性

参考文献

致谢

个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果