基因组编辑技术在果蝇染色体改造中的综合应用

摘要

果蝇作为一种重要的模式生物，从其被发现具有重要的科学研究价值开始，不同的新技术在果蝇中的成熟应用，使得果蝇在生命科学的研究中扮演着越来越重要的角色。尤其是在新基因的筛选和基因新功能的发现领域内，有着其他模式生物不可比拟的优势。
　　P-element是一类转座子，在转座酶的催化下能够将其上携带的DNA序列随机的插入到果蝇的染色体组上，是果蝇的基因组编辑中运用最为广泛的一种技术。Talens(transcription activator-like effector nucleases)和CRISPR/sgRNA(CRISPR-assoeiated single-guide RNA system)是最近几年发现的基因组编辑的新技术。Talens是transcription activator-like effectors(TALEs)和FokⅠ nuclease的融合蛋白，每个TALEs蛋白上有一个能够结合特异性DNA序列保守中心区域。通过不同单体拼接就能够构建出一个识别特异性的DNA序列的TALEs蛋白，通过左右臂两个不同的TALEs结合基因组上相近的DNA序列，FokⅠ核酸酶形成具有活性的二聚体结构，剪切识别序列中间的间隔序列，在基因组上产生DBS(double-strand breaks)。这种基因组损伤主要通过两种机制修复:nonhomologous end joining(NHEJ)和homologous recombination(HR)，由此就能对基因组上进行knock in和knock out编辑。CRISPR/sgRNA系统和TALENs系统对基因组进行编辑的机制是一样的，通过编辑包含有20nt特异性的基因组识别序列的sgRNA，可以结合不同的基因组序列，然后募集Cas9核酸酶来剪切靶位点基因组序列产生DBS。
　　本实验分为三大部分，第一部分是利用传统的P-element技术在果蝇的四号染色体上引入FRT位点。通过构建带有FRT位点的P-element质粒，并将其注射到果蝇受精卵里，通过后续的杂交过程，成功将FRT位点引入到果蝇的Ⅳ号染色体离着丝粒约3/4位置上;第二部分在实验室现有的条件下，引进果蝇基因组编辑的新技术Talens和CRISPR/sgRNA系统，主要目的根据实验室的技术条件对Talens和CRISPR/sgRNA技术的进行实际的应用和优化，为今后实验室开展果蝇基因组编辑相关实验提供可靠的实验系统。通过Talens技术对Zfh启动子上的Ci结合位点和Stat结合位点进行定点突变，分别得到了23和1个品系稳定遗传突变体用于后续的研究工作;再利用CRISPR/sgRNA对果蝇的CG8060外显子上的两个不同位点进行定点的突变，分别得到了5个和2个品系的稳定遗传的突变体，比对其表型进行后续的研究。第三部分的工作，是尝试通过结合基因组编辑的传统技术和新技术，将FRT位点引入到Ⅳ染色体上更靠近于着丝粒的位置。通过Talens的技术尚未成功的引入FRT位点，转而优化实验条件，通过Cas9进行位点筛选与鉴定，再通过同源重组的方法引入FRT位点。目前已经筛选到了合适的定点插入位点，合适的同源重组的模板正在构建当中，需要后续的工作继续开展。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 传统果蝇基因组编辑技术的简介

1．1．1 传统果蝇基因组编辑技术的介绍和重要研究作用

1．1．2 果蝇中P-element转座子介导的转基因

1．1．3 果蝇的特异性转基因

第二节 果蝇基因组编辑新技术的简介

1．2．1 Talens系统的简介和其在果蝇中的应用

1．2．2 CRISPR／Cas系统的简介和其在果蝇中的应用

第三节 FRT位点的介绍和Ⅳ染色体的研究

1．3．1 Flp／FRT系统在果蝇研究中重要作用

1．3．2 果蝇Ⅳ号染色体的简介和其研究价值

第二章 实验材料和方法

第一节 实验材料

2．1．1 果蝇

2．1．2 菌株

2．1．3 质粒和载体

2．1．4 主要仪器

2．1．5 主要试剂

2．1．6 常用溶液及其配方

2．1．7 培养基

第二节 实验方法

2．3．1 果蝇简介和基本操作方法

2．3．2 分子生物学实验

第三章 实验结果与分析

第一节 利用P-element转座子技术在果蝇Ⅳ号染色体引入FRT位点

3．1．1 P{W；neo；frt}转座子质粒的构建

3．1．2 在果蝇的染色体组引入FRT位点

3．1．3 将FRT位点引入到果蝇的Ⅳ号染色体

3．1．4 Ⅳ号染色体上FRT位点的定位和定向分析

3．1．5 去除整合的Marker基因White

第二节 利用TALEN技术对Zfh-promotor上的Ci结合位点和Stat结合位点进行定点突变

3．2．1 靶位点的选择

3．2．2 基因组序列的确定

3．2．3 利用“unit assembly”方法构建TALE

3．2．4 构建靶位点的左右臂TALEN

3．2．5 体外转录TALEN和显微注射

3．2．6 TALEN果蝇杂交实验和突变位点鉴定

第三节 利用CRISPR／Cas技术定点突变果蝇CG8060基因

3．3．1 CG8060的sgRNA的构建

3．3．2 Cas9／sgRNA果蝇胚胎的显微注射

3．3．3 Cas9／sgRNA果蝇杂交实验和突变位点鉴定

第四节 利用TALEN技术在果蝇Ⅳ染色近着丝点的位置通过同源重组引入FRT位点

3．4．1 果蝇Ⅳ染色体TALEN靶位点的选择

3．4．2 测定靶位点的基因组序列

3．4．3 Ⅳ号靶位点左右臂TALEN的构建

3．4．4 同源重组的模板的构建

3．4．5 显微注射样品的处理和显微注射

3．4．6 果蝇的杂交和同源重组事件的鉴定

第五节 综合应用传统技术和新技术在果蝇Ⅳ号染色体引入Flp／FRT系统

3．5．1 利用CRISPR／Cas技术在果蝇Ⅳ染色体引入FRT和attP位点

3．5．2 利用phic31整合系统引入Ⅳ号染色体的Flp／FRT系统

第四章 结论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果