拟南芥叶绿体中乙醇酸代谢的遗传操作

摘要

乙醇酸和乙醛酸是光呼吸途径的重要的中间代谢物，它们的积累会破坏DNA、氧化生物膜脂质、修饰蛋白结构、影响某些基因的转录并抑制酶的活性等，对植物体产生严重的毒害作用，最终影响植物正常的生长发育。因此它们的代谢过程在植物体内非常重要。除了过氧化物酶体中的乙醇酸氧化酶之外，植物叶绿体中存在着乙醇酸氧化的替代途径。另外，拟南芥中存在两种类型的乙醛酸还原酶（GR1和GR2），分别定位在细胞基质和叶绿体中。本论文旨在对叶绿体中的乙醇酸-乙醛酸代谢途径以及其和光呼吸途径的联系进行研究。
　　本文以双子叶植物拟南芥为材料，通过构建GR2的过表达载体并进行遗传转化，成功获得GR2的过表达株系。筛选得到纯合体G6、G8、G9以及G10后，利用半定量PCR和实时定量PCR技术检测到转基因株系中GR2的转录水平比野生型高2~68倍。转基因株系的GR1的转录水平略低于野生型。在转基因植株中，光呼吸途径中的 SHM1，PLGG1和 SGAT基因表达水平较野生型稍高，推测是由于转基因株系中叶绿体中乙醇酸的积累造成的。转基因植株与野生型的地上部分未有明显差异。未施加处理时，转基因株系幼苗的主根比野生型长， G6-2和G8-5差异比较显著。0.5 mmol/L SHAM处理后，15 h时根尖首先出现红色，随着时间进行，红色往上蔓延，幼苗的生长也受到明显抑制；转基因株系的主根比野生型长，尤其G6-2和G8-5差异显著；3 d后转基因和野生型幼苗均不再生长。完成PGLP1过表达载体构建和拟南芥遗传转化，成功获得 PGLP1的过表达株系，目前已获得7株转基因植株。完成GR2的敲减载体的构建和遗传转化，成功获得12株敲减株系。

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第一章 前言

第一节 乙醇酸代谢的主要途径

1.1.1 乙醇酸概述

1.1.2 乙醇酸代谢的重要性

1.1.3 乙醇酸代谢的主要途径

第二节 乙醇酸代谢的其他途径

1.2.1 叶绿体中的乙醇酸—质体醌氧化还原系统

1.2.2 丙酮酸脱氢酶

1.2.3 乙醛酸还原酶

第三节 本课题提出的意义

第四节 研究内容和实验方案

1.4.1 研究内容

1.4.2 实验方案

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 工程菌及载体

2.1.3 培养基

2.1.4 分子试剂

2.1.5 实验引物

第二节 实验方法

2.2.1 碱裂解法小量提取大肠杆菌（农杆菌）质粒

2.2.2 大肠杆菌的感受态细胞的制备

2.2.3 质粒或连接产物对大肠杆菌感受态细胞的转化

2.2.4 土壤农杆菌感受态细胞的制备

2.2.5 质粒对土壤农杆菌感受态细胞的转化

2.2.6 重组质粒的鉴定

2.2.7 PCR反应

2.2.8 酶切反应

2.2.9 DNA片段及PCR产物的回收

2.2.10 连接反应及其它修饰酶反应

2.2.11 拟南芥种子消毒

2.2.12 植物（拟南芥）基因组DNA的提取

2.2.13 土壤农杆菌介导的对拟南芥的侵染

2.2.14 转基因拟南芥纯合体的筛选

2.2.15 植物RNA的提取

第三章 结果与讨论

第一节 拟南芥过表达GR2的研究

3.1.1 拟南芥过表达载体pCAMBIA 1301-GR2的构建

3.1.2 过表达载体pCAMBIA 1301-GR2对农杆菌Gv3101菌株的转化

3.1.3 拟南芥的遗传转化及转基因植株的鉴定

3.1.4 GR2过表达植株基因转录水平分析

3.1.5 GR2过表达株系表型分析

3.1.6 小结与讨论

第二节 GR2基因敲减对拟南芥的影响

3.2.1 GR2-RNAi载体构建

3.2.2 敲减载体pCAMBIA 1301-G小-G大对农杆菌Gv3101菌株的转化

3.2.3 拟南芥的遗传转化及GR2 RNAi植株的鉴定

3.2.4 小结与讨论

第三节 拟南芥过表达PGLP1的研究

3.3.1 拟南芥叶绿体定位过表达载体1301-PGLP1的构建

3.3.2 过表达载体pCAMBIA 1301-PGLP1对农杆菌Gv3101菌株的转化

3.3.3 拟南芥的遗传转化及PGLP1过表达植株的鉴定

3.3.4 小结与讨论

第四节 总结与展望

参考文献

致谢

个人简历