拟除虫菊酯对棉铃虫神经细胞和INS-1细胞胞内Ca2+浓度及钾通道的影响

摘要

拟除虫菊酯是人工合成的一类仿生杀虫剂，主要通过干扰害虫的神经系统达到杀虫目的。由于神经敏感性和解毒机制的差异，拟除虫菊酯对哺乳动物和昆虫具有选择毒性。拟除虫菊酯类杀虫剂在常规使用剂量下对哺乳动物的毒性很低，这也是有效杀虫剂的重要特征之一。然而，拟除虫菊酯的大量使用，使很多害虫对其都产生了较强的抗药性，其中分布和寄主都很广泛的棉铃虫所表现的抗药性尤为显著。为对抗产生抗药性的害虫，田间常加大杀虫剂使用量，这使得残留在土壤、水体，甚至是进入食物链的农药量增加。拟除虫菊酯主要作用于神经系统，具有急性神经毒性。但有报道称在拟除虫菊酯长期喂养实验中，某些拟除虫菊酯还会影响其他组织器官。
　　本研究选取两种比较具有代表性的拟除虫菊酯----七氟菊酯（Ⅰ型）和溴氰菊酯（Ⅱ型），利用激光扫描共聚焦显微镜技术和膜片钳技术，从胞内钙离子浓度和质膜钾通道电生理特性两个方面分别探究拟除虫菊酯类杀虫剂对棉铃虫神经细胞和哺乳动物组织细胞INS-1的影响。通过实验得到以下结果：溴氰菊酯和七氟菊酯分别作用后，棉铃虫神经细胞内的游离 Ca2+浓度显著升高，并在药物测试浓度（10μmol/L）和测试时间内基本维持这一高 Ca2+浓度水平。但当细胞外液中无 Ca2+存在或用河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）预孵棉铃虫神经细胞后，溴氰菊酯和七氟菊酯刺激的棉铃虫神经细胞胞内 Ca2+浓度升高这一反应不再发生。说明这两种拟除虫菊酯是作用于神经细胞的细胞膜上，引发胞外钙内流，并且该反应与TTX敏感的电压门控钠通道有一定关系。溴氰菊酯和七氟菊酯也可以升高哺乳动物INS-1细胞内的游离Ca2+浓度，且该反应与胞内钙库无关。溴氰菊酯可以显著改变棉铃虫神经细胞钾通道的电生理特性，使激活曲线向超极化方向移动，通道更容易被激活。1μmol/L的溴氰菊酯使其半数激活电压（V1/2）向负电位方向移动约11mV，10μmol/L的溴氰菊酯使V1/2向负电位方向移动了约20mV，二者与对照相比统计学差异明显。而两种拟除虫菊酯中，只有溴氰菊酯显著改变了INS-1细胞钾通道激活曲线的V1/2，1μmol/L、10μmol/L溴氰菊酯分别使INS-1细胞钾通道V1/2向超极化方向移动了约5mV和6 mV。说明棉铃虫神经细胞及INS-1细胞的钾通道均是溴氰菊酯的作用靶标，且溴氰菊酯对棉铃虫神经细胞钾通道激活的影响更显著。

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本文主要缩略语表

第一章 前言

第一节 拟除虫菊酯

第二节 棉铃虫及其抗药性

第三节 胰岛素分泌机制与INS-1细胞

第四节 细胞膜离子通道及胞内钙稳态的研究简述

第五节 激光扫描共聚焦显微镜技术及细胞内钙离子浓度测定方法

第六节 膜片钳技术简述

第七节 本课题研究内容与意义

第二章 材料与方法

第一节 棉铃虫的饲养及其神经细胞的急性分离

第二节 INS-1细胞的培养

第三节 激光扫描共聚焦显微镜技术测定细胞内钙离子浓度荧光强度变化

第四节 全细胞膜片钳实验

第三章 实验结果

第一节 棉铃虫神经细胞的急性分离与培养

第二节 溴氰菊酯和七氟菊酯对棉铃虫神经细胞内钙离子浓度的影响及作用机理初探

第三节 溴氰菊酯和七氟菊酯对INS-1细胞内钙离子浓度的影响

第四节 溴氰菊酯对棉铃虫神经细胞钾通道的影响

第五节 溴氰菊酯和七氟菊酯对INS-1细胞钾通道的影响

第四章 讨论与分析

第一节 溴氰菊酯和七氟菊酯对棉铃虫神经细胞内钙离子浓度影响的分析

第二节 溴氰菊酯和七氟菊酯对INS-1细胞内钙离子浓度影响分析

第三节 溴氰菊酯对棉铃虫神经细胞钾通道影响的分析

第四节 溴氰菊酯和七氟菊酯对INS-1细胞钾通道影响的分析

第五节 拟除虫菊酯对棉铃虫神经细胞和INS-1细胞钾通道激活电压依赖性影响的差异分析

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历