自噬在神经损伤过程中的作用及其潜在机制的探究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分：自噬对三聚氰胺诱导的PC12细胞死亡的影响及机制探究
　　目的:
　　探讨自噬对三聚氰胺诱导的PC12细胞氧化损伤的影响，并进一步揭示其可能的机制。
　　方法:
　　使用分化的PC12细胞模拟神经元。MTT实验检测细胞存活率;免疫荧光、western blot检测细胞的自噬水平;流式细胞仪检测和SOD、MDA检测试剂盒评估细胞内的ROS水平。
　　结果:
　　1、三聚氰胺显著地降低了PC12细胞的存活率，并具有浓度依赖性。在三聚氰胺处理的细胞中，雷帕霉素可以提高细胞存活率，3-MA则降低细胞存活率。
　　2、三聚氰胺显著地提高了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例，beclin-1和Atg7的水平，并具有浓度依赖性。在三聚氰胺处理的细胞中，雷帕霉素/3-MA可以分别提高/降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例和beclin-1的水平。
　　3、流式细胞仪检测发现，在三聚氰胺处理的细胞中，雷帕霉素降低DCFH-DA着色的细胞数，3-MA提高了DCFH-DA着色的细胞数。
　　4、在三聚氰胺处理的细胞中，雷帕霉素提高了T-SOD活力，降低了MDA水平，3-MA则降低了T-SOD活力，提高了MDA水平。
　　结论:
　　自噬通过降低ROS水平有效地缓解三聚氰胺诱导的PC12细胞死亡。
　　第二部分：白藜芦醇诱导的自噬对Aβ引起的神经损伤的影响及机制探究
　　目的:
　　探讨白藜芦醇对Aβ引起的神经损伤的影响，并进一步揭示其潜在的机制。
　　方法:
　　使用7-14天Wistar大鼠脑片，分为control组、Aβ组和Aβ+Resveratrol组。记录动作电位(AP)、快速失活钾离子通道（IA）和延迟整流钾离子通道（IK）电流。另一方面，使用分化的PC12细胞模拟神经元。MTT实验检测细胞存活率。免疫荧光实验和Western Blot实验检测自噬水平。检测T-SOD、GSH、MDA和H2O2水平来反映细胞内ROS水平。Hoechst33258染色和ELISA检测caspase-3活力反映细胞凋亡水平。
　　结果:
　　1、Aβ提高海马神经元的动作电位的频率和半峰宽，白藜芦醇则恢复Aβ引起的动作电位的频率和半峰宽的提高
　　2、Aβ抑制海马神经元的IA和IK电流，使IA和IK的激活曲线左移，使IA的失活曲线左移，白藜芦醇可以恢复Aβ引起的IA和IK通道功能的异常。
　　3、Aβ引起PC12细胞存活率降低，并具有浓度依赖性，白藜芦醇可以恢复Aβ引起的PC12细胞存活率的降低。
　　4、Aβ增加自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例和beclin-1的表达，白藜芦醇则进一步提高自噬相关蛋白的表达，3-MA则抑制Aβ和白藜芦醇引起的自噬。
　　5、Hoechst33258染色实验和ELISA检测caspase-3活力发现，Aβ可以增加核断裂和凋亡小体的形成和caspase-3的活力，说明细胞凋亡水平升高。细胞的凋亡水平在Aβ+Resveratrol组明显少于Aβ组;而Aβ+Resveratrol+3-MA组多于Aβ+Resveratrol。
　　6、T-SOD、GSH、MDA水平反映细胞内ROS水平。实验发现Aβ提高细胞ROS水平。Aβ+Resveratrol组比Aβ组ROS水平明显降低，而Aβ+Resveratrol+3-MA组比Aβ+Resveratrol组ROS水平明显提高。
　　结论:
　　白藜芦醇通过提高自噬明显缓解了Aβ引起的神经元氧化损伤。
　　第三部分：雷帕霉素诱导的自噬对AD模型小鼠认知功能的影响及机制探究
　　目的:
　　探讨雷帕霉素对AD模型小鼠的认知能力的影响，并进一步探讨其机制是否与自噬的激活相关。
　　方法:
　　使用2月龄雄性APP/PS1转基因小鼠作为AD模型小鼠，使用转基因鼠同窝的野生型小鼠作为对照组。分为CON组(n=8);Rap组(n=8);AD组(n=8)和AD+Rap组(n=8)。Rap组和AD+Rap组腹腔注射雷帕霉素2mg/kg/d2个月。水迷宫实验和新异物体识别实验检测动物空间学习与记忆功能。应用电生理技术检测海马PP到DG的LTP和DEP。应用western blot技术检测海马中自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达量和凋亡相关蛋白Bax的表达量。
　　结果:
　　1、雷帕霉素显著地降低了AD小鼠水迷宫正向和反向的定位航行阶段的逃避潜伏期，并增加了正向和反向的目标象限的停留时间百分比及平台穿越次数。同时雷帕霉素显著地提高了AD小鼠新异物体实验中识别新物体的比例。
　　2、与CON组比较，AD小鼠海马DG区LTP显著降低而DEP明显增加，AD+Rap组与AD组相比LTP显著增加且DEP明显降低。
　　3、与CON组比较，AD小鼠海马LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例和Beclin-1水平明显降低，AD+Rap组与AD组相比LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例和Beclin-1水平明显提高。
　　4、与CON组比较，AD小鼠海马bax的表达明显升高，AD+Rap组与AD组相比bax的表达明显降低。
　　结论:
　　雷帕霉素通过提高自噬改善AD模型小鼠的认知障碍和神经元的凋亡。
　　第四部分：居住环境对C57小鼠自噬活动、兴奋性/抑制性神经传递平衡、突触可塑性和认知功能影响的研究
　　目的:
　　探讨丰富环境和社会隔离对C57小鼠认知功能和突触可塑性的影响，并进一步揭示其潜在的生物学机制。
　　方法:
　　将1月龄的雄性C57小鼠随机分为CON组(n=6);EE组(n=6)和SI组(n=6)。建模时间为两个月。水迷宫实验和新异物体识别实验检测动物空间学习与记忆功能。应用电生理技术记录海马PP到DG的的LTP和DEP。应用Western blot技术检测海马中突触相关蛋白SYP、PSD-95表达量;突触受体NR2A、NR2B、GABAAR表达量;自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、P62表达量。
　　结果:
　　1、相比CON组EE组/SI组分别降低/提高小鼠水迷宫正向和反向的定位航行阶段的逃避潜伏期;相比CON组EE组/SI组分别增加/降低了正向和反向的目标象限的停留时间百分比及平台穿越次数。同时相比CON组EE组小鼠新异物体实验中识别新物体的比例明显提高;而SI组则明显降低。
　　2、相比CON组EE组小鼠DG区LTP显著提高而DEP明显降低;SI组相比于CON组LTP显著降低而DEP明显增加。
　　3、EE组小鼠海马PSD-95的含量比CON组明显提高而SI组则明显降低。SYP的含量三组则没有明显差异。
　　4、EE组小鼠相对于CON组海马NR2A、NR2B的含量明显提高;SI组小鼠相对于CON组海马GABAAR的含量明显提高。
　　5、EE组小鼠相对于CON组海马LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例和Beclin-1的含量明显提高，P62含量明显降低;SI组小鼠相对于CON组海马LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例和Beclin-1的含量明显降低，P62含量明显提高。
　　结论:
　　丰富环境和社会隔离可能通过影响兴奋性/抑制性神经传递的平衡和神经元自噬活动改变C57小鼠的认知能力和突触可塑性。

目录

声明

摘要

本文主要缩略语表

第一部分 自噬对三聚氰胺诱导的PC12细胞死亡的影响及机制探究

第一章 引言

第一节 Melamine概述

第二节 自噬概述

第二章 材料和方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三节 实验数据处理与分析

第三章 实验结果

第一节 三聚氰胺降低PC12细胞存活率

第二节 三聚氰胺提高了PC12细胞的自噬水平

第三节 Rapamycin和3-MA对于三聚氰胺处理的PC12细胞自噬的影响

第四节 Rapamycin和3-MA改变了三聚氰胺诱导的细胞氧化损伤

第四章 讨论

小结

第二部分 白藜芦醇诱导的自噬对Aβ引起的神经损伤的影响及机制探究

第一章 引言

第一节 白藜芦醇概述

第二节 膜片钳技术

第二章 材料和方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三节 实验数据处理与分析

第三章 实验结果

第一节 白藜芦醇缓解了Aβ诱导的神经损伤

第二节 Resveratrol缓解了Aβ诱导海马神经元兴奋性增加

第三节 白藜芦醇缓解了Aβ对CA1区神经元电压门控钾通道的损伤

第四节 Resveratrol对Aβ处理的PC12细胞自噬的影响

第五节 Resveratrol诱导的自噬缓解Aβ引起的细胞凋亡

第六节 Resveratrol诱导的自噬缓解Aβ引起的氧化应激

第四章 讨论

小结

第三部分 雷帕霉素诱导的自噬对AD模型小鼠认知功能的影响及机制探究

第一章 引言

第一节 雷帕霉素概述

第二节 学习记忆与突触可塑性

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三节 实验数据处理与分析

第三章 实验结果

第一节 Morris水迷宫实验

第二节 新异物体实验

第三节 In vivo电生理实验

第四节 Western blot实验

第四章 讨论

小结

第四部分 居住环境对C57小鼠自噬活动、兴奋性／抑制性神经传递平衡、突触可塑性和认知功能影响的研究

第一章 前言

第一节 丰富环境与认知功能的改善

第二节 社会隔离与神经系统疾病

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三节 实验数据处理与分析

第三章 实验结果

第一节 Morris水迷宫实验

第二节 新异物体实验

第三节 In vivo电生理实验

第四节 Western blot实验

第四章 讨论

小结

结语和展望

第一节 主要结论

第二节 主要创新点

第三节 研究前景与展望

参考文献

致谢

个人简历

发表论文