兰属(Cymbidium)植物与其内生真菌间共生关系的初步研究

摘要

为探讨兰属植物与内生真菌间的专一性，以及二者的共生关系，本研究以云南的6种兰属（Cymbidium）植物春剑(C.longibracteatum)、春兰(C.goeringii)、蕙兰(C.faberi)、送春(C.cyperifolim)、建兰(C.ensifolium)、莲瓣兰(C.tortisepalum)作为研究材料，对其肉质根分离内生真菌，同时采用ITS分子技术分析其遗传多样性，并以分离得到的内生真菌与兰属植物组培根状茎进行回接试验和兰属植物杂交种子进行共生萌发试验。主要研究结论如下:
　　1、从6种兰属植物中分离到30种内生真菌，真菌形态学特征观察和菌株ITS序列Blast比对结果皆显示这30种内生真菌隶属于镰刀菌属(Fusariumsp)、毛壳菌属(Chaetomiumsp)、柱孢霉属(Cylindrocarponsp)和瘤菌根菌属（Epulorhizasp）。
　　2、分离的30种内生真菌ITS1-5.8S-ITS2序列总长429～563bp，GC含量为41.67％～58.06％,其中ITS1长92～259bp，GC含量为47.66％～58.62％;5.8S长155～158bp，GC含量为40.81％～52.05％;ITS2长146～192bp，GC含量为38.78％～55.56％;聚类分析显示，分离自送春、蕙兰、建兰的内生真菌皆属于镰刀菌属，聚在Ⅰ组上;分离自春剑的内生真菌除CJ7单独聚在Ⅳ组外，其他均聚在Ⅰ组上;分离自春兰的内生真菌聚在Ⅰ、Ⅱ2个分支上，分离自莲瓣兰的内生真菌聚在Ⅱ、Ⅲ2个分支上。ITS序列分析表明春剑、春兰、莲瓣兰、蕙兰内生真菌分别包含292，117，115，75个变异位点。这些说明成年植株春剑、春兰、莲瓣兰和蕙兰中分离得到的内生真菌的遗传多样性较送春、建兰中内生真菌的遗传多样性丰富。
　　3、分离到的30种内生真菌与春兰根状茎的共生试验表明，能促进根状茎分化出大量或少量不定芽的共有10种菌株，其促进作用效果依次LBL2＞CJ6＞CL6＞CL5＞CL1＞LBL1＞HL1＞CJ4＞CJ2＞CJ7。光学显微镜和电子扫描电镜观察表明，真菌入侵时，兰属植物根状茎表皮及相邻的皮层细胞内细胞核、叶绿体等细胞器逐渐消失，细胞异常变大，向外形成凸状。菌丝通过破坏凸状处的表皮细胞细胞壁进入皮层，在外皮层、中皮层、内皮层中均有分布，并在皮层细胞形成菌丝结和被消化。扫描电镜图显示，被真菌入侵后的根状茎横切面组织表面分布有球形颗粒状物质。分离到的30种内生真菌与莲瓣兰与春剑、春剑与春兰互为母本、父本杂交种子室内萌发试验，目前没有观察到种子有萌发迹象，其萌发条件及共生机理有待进一步探讨。
　　4、实验结果发现，兰属植物与内生真菌共生的专一性受兰属植物种类、生存环境、生长阶段、真菌分布范围等因素影响，其具体专一性机制有待进一步研究。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 兰科植物与内生真菌共生关系研究进展

1．1．1 兰科植物与内生真菌共生细胞学和形态学研究进展

1．1．2 兰科植物与内生真菌共生营养关系研究进展

1．1．3 兰科植物与内生真菌互作的分子水平研究

1．1．4 兰科植物与共生真菌共生专一性问题

1．2 兰科植物与内生真菌共生关系研究方法的应用

1．2．1 兰科植物共生真菌的分离方法

1．2．2 兰科植物内生真菌的鉴定方法

1．2．3 兰科植物与其内生真菌共生体组织学研究

1．3 本文研究目的和意义

第二章 兰属植物内生真菌的分离与形态学鉴定

2．1 材料

2．2 方法

2．2．1 分离兰属植物内生真菌的培养基

2．2．2 兰属植物内生真菌的分离

2．2．3 内生真菌培养特征及光学显微镜特征观察

2．3 结果与分析

2．3．1 兰属植物内生真菌的分离结果

2．3．2 内生真菌的形态学特征观察结果

2．3．3 基于兰属植物内生真菌菌落和光学显微镜特征的初步鉴定

2．4 结论与讨论

2．4．1 兰属植物的形态学鉴定

2．4．2 不同因素对兰科植物内生真菌分离的影响

第三章 兰属植物内生真菌的rDNA ITS分析

3．1 材料

3．2 方法

3．2．1 培养内生真菌的培养基的配制

3．2．2 兰属植物内生真菌DNA的提取

3．2．3 兰属植物内生真菌ITS区段的PCR扩增及测序

3．2．4 兰属植物内生真菌的ITS区段分析

3．3 结果与分析

3．3．1 兰属植物内生真菌rDNA ITS扩增产物检测结果

3．3．2 兰属植物内生真菌rDNA ITS序列Blast比对结果

3．3．3 兰属植物内生真菌rDNA ITS序列分析

3．3．4 兰属植物内生真菌的rDNA ITS区段的系统发育分析

3．4 结论与讨论

3．4．1 ITS分子技术鉴定兰属植物内生真菌

3．4．2 兰属植物内生真菌ITs序列变异

3．4．3 成年兰属植物与其内生真菌间的专一性

第四章 兰属植物与内生真菌共生结构观察

4．1 材料

4．1．1 内生真菌

4．1．2 兰属植物种子

4．1．3 兰属植物根状茎

4．1．4 新鲜的青冈树叶片

4．2 方法

4．2．1 兰属植物与其内生真菌共生培养基质的配制

4．2．2 培养染菌叶

4．2．3 兰属植物种子与内生真菌共生萌发

4．2．4 兰属植物根状茎与内生真菌共生培养

4．2．5 兰属植物根状茎与内生真菌共生结构的观察

4．2．6 兰属植物根状茎与内生真菌共生结构的扫描电镜观察

4．3 结果与分析

4．3．1 兰属植物种子与内生真菌共生萌发

4．3．2 兰属植物根状茎与内生真菌共生

4．3．3 兰属植物根状茎与内生真菌共生结构的观察

4．4 结论与讨论

4．4．1 影响兰属植物种子与内生真菌共生萌发的因素

4．4．2 不同内生真菌对兰属植物春兰根状茎的影响

4．4．3 兰属植物根状茎及种子与其内生真菌间的专一性

4．4．4 兰属植物春兰根状茎与其内生真菌共生结构

结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的与学位论文内容相关的学术论文及研究成果