临床相关的微米级载阿仑膦酸钠超高分子量聚乙烯磨屑的研究

摘要

目前人工关节置换术已成为治疗关节疾病的重要手术之一，但人工关节磨屑导致的骨溶解和无菌性松动局限了人工关节的使用寿命。人工关节组件中超高分子量聚乙烯(UHMWPE)不仅最易发生磨损，其磨屑占磨屑总量的70％～90％，而且UHMWPE磨屑的诱导骨溶解作用最明显，是导致人工关节周围骨溶解产生无菌性松动的主要诱因。因此研究UHMWPE磨屑对无菌性松动的影响至关重要。
　　课题组前期研制了载抑制骨溶解药物阿仑膦酸钠(ALN)的超高分子量聚乙烯(UHMWPE-ALN)材料;采用细胞培养评价UHMWPE-ALN和UHMWPE磨屑对巨噬细胞的影响。但由于静电作用和磨屑形状等因素导致UHMWPE-ALN磨屑分离困难，因此前期细胞评价采用的磨屑尺寸仅小于40μm，只有10％左右在0.1～10μm范围。而临床研究中发现90％以上的磨屑在0.1～10μm范围，并且该范围内的磨屑具有较强的生物反应，因此本试验主要研究临床相关微米级UHMWPE-ALN和UHMWPE磨屑的制备、材料学性能、药物释放和生物学评价。此外，本课题组前期分别采用倒置培养和正置培养对巨噬细胞进行了研究，但是由于细胞培养参数不同以及人为因素的干扰，得到的数据无法判断不同模型对细胞的影响。因此本试验还将同时进行正置和倒置培养，研究两种模型对巨噬细胞的影响;此外分别研究UHMWPE-ALN和UHMWPE磨屑与钴铬合金(Co-Cr)颗粒混合物对巨噬细胞活性的影响。
　　本研究采用溶剂挥发法热压制备了UHMWPE-ALN和UHMWPE板材，在干燥条件下使用表面粗糙的摩擦副制备了大量的UHMWPE-ALN和UHMWPE磨屑，通过负压环境下滤膜逐级过滤技术分离得到临床相关微米尺寸的磨屑。采用激光粒度仪、扫描电镜(SEM)、傅里叶红外光谱分析(FTIR)、X射线衍射分析(XRD)和差示扫描量热法(DSC)表征UHMWPE-ALN和UHMWPE磨屑和板材的物化性质，并采用茚三酮比色法研究临床相关微米尺寸的UHMWPE-ALN磨屑的体外药物释放。比较研究正置培养和倒置培养两种细胞培养模型对磨屑和巨噬细胞共培养的影响以及两种材料混合物对细胞的影响。通过光镜及SEM观察巨噬细胞形态，通过噻唑蓝(MTT)比色法评价磨屑对巨噬细胞的增殖的影响，通过乳酸脱氢酶释放检测(LDH)评价两种培养模型对细胞损伤程度的影响，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)评价磨屑对巨噬细胞的溶骨性细胞因子TNF-α和IL-6的分泌功能的影响。
　　激光粒度仪和SEM结果表明通过负压环境下滤膜逐级过滤技术分离后UHMWPE-ALN和UHMWPE磨屑的平均粒径分别为6.98μm和5.65μm，粒径分布集中，90％磨屑的尺寸在0.1～10μm范围内，与临床患者体内磨屑尺寸分布相似，较分离前UHMWPE-ALN和UHMWPE磨屑粒径明显下降;磨屑形貌多呈块状或片状，与临床患者体内获得的磨屑形貌相似;根据磨屑的尺寸和形貌表明本实验制备出了临床相关的微米级磨屑。FTIR分析结果表明ALN的加入没有改变UHMWPE的化学结构，UHMWPE在热压过程中发生氧化反应，而ALN在热压过程中保持热稳定性，制备和分离磨屑过程不会对UHMWPE和ALN的化学结构产生影响。XRD和DSC结果表明热压过程、磨屑的制备分离过程和ALN的加入不会改变UHMWPE的晶体结构和晶粒尺寸，但是热压过程中晶体的完善程度受到影响，板材的结晶度降低。
　　临床相关微米级载药磨屑的体外药物释放结果表明UHMWPE-ALN磨屑体外释放分为两个阶段，即1d前的突释阶段和1～90 d的缓慢释放阶段。药物突释阶段，主要是磨屑表面富集的ALN释放，磨屑粒径对药物释放率有很大的影响;缓慢释放阶段，ALN的释放主要是由于团聚磨屑分散和UHMWPE-ALN磨屑内的ALN扩散导致，该阶段符合Higchi药物扩散模型。UHMWPE-ALN磨屑在温度为37℃的PBS环境中浸泡90 d没有发生氧化现象。
　　体外细胞实验结果表明巨噬细胞对临床相关的微米级磨屑有吞噬和趋化作用，磨屑的加入导致巨噬细胞为了吞噬异物发生形态改变;在正置培养和倒置培养两种细胞培养模型下，UHMWPE-ALN磨屑与巨噬细胞共培养的细胞活性均小于UHMWPE磨屑组，ALN可以抑制巨噬细胞的活性;当磨屑浓度是0.02 mg/mL时促进巨噬细胞增殖的能力最强;两种培养模型对巨噬细胞活性没有显著性影响，但是倒置培养时ALN对巨噬细胞的抑制作用更加明显，LDH结果显示倒置培养模型对巨噬细胞的损伤作用较大;临床相关的微米级UHMWPE-ALN和UHMWPE磨屑可以促进巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6，巨噬细胞分泌TNF．α和IL-6不是同时进行的，并且巨噬细胞分泌IL-6的能力小于分泌TNF-α的能力;UHMWPE促进巨噬细胞增殖，而Co-Cr则抑制巨噬细胞增殖;两者材料混合物与巨噬细胞共培养时，Co-Cr的加入不会影响UHMWPE对巨噬细胞增殖的促进作用。
　　本研究提供了一种制备临床相关的微米级UHMWPE磨屑的方法，为进一步临床应用提供科学依据。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 人工髋关节置换术概述

1．1．1 人工髋关节置换术的发展历史及现状

1．1．2 人工髋关节置换术存在的问题

1．1．3 超高分子量聚乙烯材料

1．2 超高分子量聚乙烯磨屑分析的现状研究

1．2．1 磨屑的产生方式

1．2．2 超高分子量聚乙烯磨屑分析

1．3 磨屑诱发骨溶解

1．3．1 磨屑诱发骨溶解的途径

1．3．2 骨溶解的研究评价方法

1．4 UHMWPE磨屑与细胞共培养研究

1．4．1 体外培养模型的建立

1．4．2 内毒素污染

1．4．3 磨屑与对细胞共培养的影响因素

1．5 本课题的前期工作基础

1．6 课题研究目标和研究内容

1．6．1 课题的研究目标

1．6．2 课题的研究内容

第2章 载药超高分子量聚乙烯及磨屑的制备和表征

2．1 引言

2．2 试验材料与方法

2．2．1 载药超高分子量聚乙烯的制备

2．2．2 载药超高分子量聚乙烯磨屑的制备

2．2．3 载药超高分子量聚乙烯及磨屑的表征

2．3 试验结果与讨论

2．3．1 磨屑粒径分析

2．3．2 磨屑的形貌表征

2．3．3 红外光谱分析

2．3．4 X射线衍射分析

2．3．5 结晶度的测定

2．4 小结

第3章 临床相关的微米级载药超高分子量聚乙烯磨屑的体外药物释放

3．1 引言

3．2 试验材料和方法

3．2．1 水合茚三酮溶液、磷酸盐缓冲液和碳酸氢钠溶液的配制

3．2．2 临床相关的载药磨屑的体外释放

3．2．3 临床相关的载药磨屑体外释放的表征

3．3 试验结果与讨论

3．3．1 标准曲线的制备

3．3．2 临床相关载药磨屑的药物释放率

3．3．3 临床相关载药磨屑氧化度分析

3．4 小结

第4章 临床相关微米级载药超高分子量聚乙烯磨屑的生物学评价

4．1 引言

4．2 试验材料与方法

4．2．1 巨噬细胞培养

4．2．2 磨屑与巨噬细胞共培养

4．2．3 巨噬细胞形态观察

4．2．4 磨屑与巨噬细胞共培养活性检测

4．2．5 巨噬细胞细胞因子检测

4．2．6 统计学处理

4．3 试验结果与讨论

4．3．1 细胞形态分析

4．3．2 巨噬细胞活性检测

4．3．3 细胞因子检测

4．4 小结

结论

致谢

参考文献