磷脂/特异性多肽仿生多功能涂层的构建及其生物相容性研究

摘要

晚期血栓和支架内再狭窄等并发症是心血管支架临床应用所面临的主要问题。心血管植入材料表面仿生改性并使材料表面性能趋于天然血管内膜，以达到抗凝血及内皮化功能的理念是研究者们关注的热点。目前，心血管支架材料表面修饰的功能分子种类很多，从表面不同功能的设计出发选择不同功能的生物分子构建仿生表面。本研究选择了具有非特异性阻抗作用仿细胞膜结构的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)及对内皮祖细胞具有特异性识别与捕获的多肽(TPSLEQRTVYAK-GGGC-K，PT)作为目标分子，在钛(Ti)基材表面构建了单层型和多聚赖氨酸(PLL)、纤连蛋白(Fn)介导的复合型两类具有抗凝血、抗增生和快速内皮化的磷脂/内皮祖细胞识别肽多功能涂层，并对涂层表面进行了理化性质、血液、细胞及动物体内评价。
　　论文首先通过传统自由基聚合反应将2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)与甲基丙烯酸(MA)聚合，得到含羧基（-COOH）的类磷脂聚合物PMMPC。利用（-COOH）与氨基(-NH2)间发生酰胺缩合反应引入多巴胺(DA)，得到类磷脂聚合物PMMDA。含羧基（-COOH）的PMMDA与含-NH2的内皮祖细胞识别肽分子(PT)作用，得到含磷脂、PT及多巴胺(DA)的新型仿细胞膜结构的类磷脂多功能聚合物PMMDP。PMMDA和PMMDP在碱性条件下被氧化成类磷脂聚合物POMMDA和POMMDP。通过红外光谱(FTIR)、核磁(1HNMR)、凝胶渗透色谱(GPC)及紫外光谱等检测方法证明了系列类磷脂聚合物的成功合成。
　　利用新型磷脂聚合物PMMDP中的儿茶酚基团与钛基底材料的鳌合作用，在Ti表面成功构建Ti@PMMDP仿生涂层。运用FTIR、XPS、SEM、AFM、水接触角、QCM-D等方法对该涂层进行定性与定量表征。将样品浸没于PBS溶液中37℃恒温摇床震荡22天后对涂层稳定性进行了检测，结果发现涂层具有良好的稳定性。研究发现新型磷脂聚合物PMMDP涂层中的磷脂基团能有效地抑制血小板的粘附与激活、纤维蛋白原的粘附与变性，并能有效地抑制SMCs的过度增生，对ECs的生长没有明显的影响;Ti@PMMDP涂层中的特异性识别肽PT对EPCs细胞的粘附、归巢与增殖有明显的促进作用。
　　为了进一步提高磷脂胆碱基团和特异性识别肽PT在功能表面的表达量，选择多聚赖氨酸(PLL)和纤连蛋白(Fn)介导构建了多层含MPC和PT的自组装体系。通过鳌合作用将PMMDA固定于Ti表面，分子间再通过静电吸附、共价结合、氢键作用、迈克尔加成和西佛碱反应依次组装PLL/Fn、POMMDA/POMMDP、PT分子。体外血液及细胞相容性评价和相关机理分析表明，含有磷脂基团的表面都表现出了良好的抗凝血性能，同时对平滑肌细胞表现出了一定的抑制作用，对内皮细胞没有明显的影响;PT分子对内皮祖细胞的归巢和增殖都有明显的促进作用，且PT的表达量与促进增殖能力正性相关。通过全面的生物学性能比较发现，以PLL介导的Ti@PCDLOPTPT表面具有相对更好的抗凝血、抑制平滑肌细胞增殖及促进内皮祖细胞归巢和增殖的性能。动物体内埋植15天和30天结果显示，该表面能有效地抗血栓和抑制内膜过度增生，并通过识别和捕获循环血液中成熟的EPCs加快内皮化速率。
　　综上所述，本论文着眼于心血管植入材料抗凝促内皮的特殊要求，选择了MPC及PT构建多功能表面，论证了在心血管材料表面构建抗凝促内皮化多功能表面的可行性，该认识为后续研究提供了很有价值的理论指导意义。

目录

声明

摘要

1．1 引言

1．2 血管支架及其表面功能化修饰

1．2．1 血管支架的发展历程

1．2．2 血管支架材料表面功能化修饰

1．3 诱导体内成熟内皮祖细胞(EPCs)内皮化

1．3．1 EPCs的来源及其功能

1．3．2 材料表面生物修饰诱导体内内皮化

1．4 仿细胞膜结构的类磷酸胆碱(MPC)

1．4．1 MPC在心血管材料表面的应用及抗凝血机理

1．4．2 MPC在其他领域的应用

1．5 课题的研究目的与意义、主要内容及技术路线

1．5．1 课题的提出、目的及意义

1．5．2 研究内容及技术路线

1．6 本课题的来源

第2章 仿生类磷脂聚合物的制备、表征和优化

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器与试剂

2．2．2 MPC与甲基丙烯酸(MA)共聚物(PMMPC)的合成

2．2．3 多巴胺(DA)修饰的磷酸胆碱聚合物(PMMDA)的合成

2．2．4 EPCs-识别肽(PT)与多巴胺修饰的磷脂聚合物(PMMDP)的合成

2．2．5 氧化态磷脂聚合物POMMDA70及POMMDP的制备

2．2．6 磷脂聚合物PMMPC、PMMDA及PMMDP的检测

2．2．7 数据处理及分析

2．3 结果与分析

2．3．1 PMMPG聚合物的表征分析

2．3．2 PMMDA聚合物的表征分析

2．3．3 三种PMMDA体外血液相容性优化结果分析

2．3．4 PMMDP聚合物的表征分析

2．3．5 磷脂聚合物POMMDA与POMMDP的表征

2．4 讨论

2．5 本章小结

第3章 Ti表面PMMDP仿生涂层的构建、表征及生物学行为评价

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 仿生涂层的构建

3．2．2 仿生涂层的材料学表征

3．2．3 涂层稳定性检测

3．2．4 仿生涂层的生物学评价

3．2．5 数据处理及分析

3．3 结果与分析

3．3．1 涂层表面的理化性质

3．3．2 涂层稳定性检测

3．3．3 涂层表面的血液相容性

3．3．4 涂层表面的细胞相容性

3．4 讨论

3．5 本章小结

第4章 多聚赖氨酸、纤连蛋白介导的磷脂／多肽聚合物多功能涂层的构建与优化

4．1 引言

4．2 PLL介导的功能涂层组装工艺、表征及生物学评价

4．2．1 PLL介导的层层自组装工艺

4．2．2 PLL介导的功能涂层的表征

4．2．3 PLL介导的功能涂层生物学评价与工艺筛选

4．3 纤连蛋白Fn介导的功能涂层组装工艺及生物学评价

4．3．1 Fn介导的层层自组装工艺

4．3．2 Fn介导的功能涂层的表征

4．3．3 Fn介导的功能涂层生物学评价及工艺筛选

4．4 讨论

4．5 本章小结

第5章 基于PMMDP、PLL与Fn的仿生多功能涂层的性能比较及体内评价

5．1 引言

5．2．1 体外血小板粘附与激活

5．2．2 体外动态全血实验

5．3 细胞相容性评价

5．3．1 内皮祖细胞生长及增殖能力检测及结果

5．3．2 平滑肌细胞生长及增殖能力检测及结果

5．3．3 内皮细胞生长及增殖能力检测及结果

5．4 Ti@PCDLOPTPT仿生多功能涂层的内皮祖细胞动态捕获

5．5 动物体内植入实验

5．5．1 实验方法

5．5．2 结果及分析

5．6 讨论

5．7 本章小结

结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及科研成果