cbbX及孢子形成相关蛋白基因在海带配子体发育中的差异表达

摘要

海带(Laminaria japonica)是我国海水养殖业中重要的经济海藻，生活史中存在着明显的大型孢子体和微型配子体的世代交替。在相同的条件下，雄配子体可育率较雌配子体高，且雄配子体产生配子囊较雌配子体早3-5 d，表明雌、雄配子体在发育过程中存在着某些基因的差异表达或特异基因表达。本研究从差异表达基因的筛选和分离出发，探究造成这种差异的遗传背景。 分别根据本实验室消减文库中筛选出的、且为雄性差异表达的18与b9克隆序列设计基因特异性引物(gene-specific primers，GSP)，利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)进行PCR扩增，共获得两条cDNA全长。其中，一条长2 087 bp，开放阅读框1275 bp，5'非翻译区118 bp，3'非翻译区694 bp，编码一个含有424个氨基酸的前体蛋白，而且具有明显的polyA尾巴；预测蛋白分子量46.98 kD，等电点5.36。蛋白氨基端的前19个氨基酸为信号肽序列，信号肽酶切位点在19 Ala与20 Phe之间。酶切后的成熟蛋白分子量为45.26 kD，等电点为5.28；蛋白同源搜索显示，与蓝隐藻(Guillardia theta)、赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo)、Porphyrapurpurea、Galdieria sulphuraria 等藻类CbbX同源性分别为66％、58％、56％、51％，命名该基因为cbbX(GenBank登录号：EF490312)。CbbX蛋白高级结构预测，有四个明显的α-螺旋和五个平行的β-折叠片。基于不同物种12个CbbX同源蛋白序列构建了Neighbor-joining的分子进化树，蓝隐藻核形体编码的CbbX蛋白与质体编码的位于不同的进化分支上，海带CbbX与蓝隐藻核形体编码的亲缘关系较近。CbbX蛋白有保守的AAAATPase结构域及相应的ATP结合位点。另一条cDNA全长831 bp，开放阅读框450 bp，5'非翻译区182 bp，3'非翻译区199 bp，具有明显的polyA尾巴；编码一个含有149个氨基酸的蛋白，推测其分子量为17.2 kD，等电点理论值为10.46；经蛋白同源分析，与点形念珠藻(Nostoc punctiforme)孢子形成相关蛋白具有30％的相似性，暂对该基因拟名为孢子形成相关蛋白基因(sporulation- related-protein gene，srp)(GenBank登录号：EF490313)。 分别根据孢子形成相关蛋白基因srp和cbbX基因cDNA全长序列设计引物，运用荧光定量PCR技术，研究它们在海带配子体发育过程中的表达特性。结果表明上述两基因在雌配子体中优先表达，且具有阶段特异性；cbbX基因有助于RuBisCo表达，推测其与海带配子释放相关。另外，成功构建了孢子形成相关蛋白基因srp原核表达载体，为下一步蛋白表达及功能鉴定奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章cbbX基因克隆及在海带配子体发育过程中的表达

第一节cbbX基因的cDNA全长克隆及序列分析

1.1.1材料

1.1.2方法

1.1.3结果与讨论

第二节cbbX基因在海带配子体发育中的表达谱分析

1.2.1材料

1.2.2方法

1.2.3结果

1.2.4讨论

第二章海带孢子形成相关蛋白基因srp的克隆、序列分析及表达

第一节孢子形成相关蛋白基因srp的克隆及其序列分析

2.1.1材料

2.1.2方法

2.1.3结果

2.1.4讨论

第二节srp基因在海带配子体发育中的表达谱分析

2.2.1材料

2.2.2方法

2.2.3结果

2.2.4讨论

第三节srp基因原核表达载体构建

2.3.1材料

2.3.2方法

2.3.3结果

2.3.4讨论

第三章结论

参考文献

附录

致谢