纳米结构钛表面凝胶层控释双重炎性因子调控巨噬细胞表型极化的研究

摘要

在生物医学工程领域，包括组织工程支架、医疗器械、药物控释载体等在内的所有外源性材料在进入体内后均会与机体组织产生免疫反应，而炎症反应在该过程中发挥着重要作用。已有研究表明，适度的炎症反应能够促进组织再生早期的血管生成，而过度的炎症反应则不利于植入体与组织之间形成牢固结合，甚至会导致植入体失效。在炎症反应的各个阶段，巨噬细胞（macrophage）以不同表型（phenotype）发挥着重要的调控作用。其中，“经典活化型”（M1）和“选择活化型”（M2）的巨噬细胞是两种主要表型，M1被认为能够促进炎症发生和持续，M2能够减弱炎症反应，促进组织愈合。因此，炎症反应中M1-M2的时序转化对创伤愈合和组织再生过程至关重要。 我们通过模拟正常组织修复过程，将生物材料与药物控释结合起来，制备得到了一种新型的免疫调节材料。并评价了其材料学性质、生物相容性，以及对巨噬细胞表型转变的调控作用。 本研究以纯钛作为底材，首先对其进行纳米结构化表面改性，得到垂直于基底生长的氧化钛纳米管（TNT）阵列，然后在其表面覆盖双层凝胶，下层为京尼平交联的羧甲基壳聚糖凝胶，上层为 β-甘油磷酸钠交联的壳聚糖凝胶。该材料体系作为控释药物载体，分别将促炎因子干扰素-γ（IFN-γ）和抑炎因子白细胞介素-4（IL-4）载入凝胶层和纳米管。通过两种因子所处空间位置和凝胶层的控释作用来实现 IFN-γ的快速释放和IL-4的持续释放。扫描电镜显示凝胶层完整覆盖TNT表面且相对光滑；红外光谱证明交联反应确实发生；体外降解实验表明凝胶层在短期（0-7天）没有明显降解，主要表现出溶胀行为，在7天以后降解速率加快，凝胶层表面出现孔洞且厚度变薄。另外，凝胶层在溶菌酶（lysozyme）溶液中的降解速率高于磷酸盐缓冲液（PBS）中。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）测定材料中IFN-γ和IL-4的释放行为也发现，IFN-γ在前期（0-3天）大量释放，IL-4则表现出持续释放的趋势。 我们采用间充质干细胞（MSCs）和巨噬细胞评价了材料的细胞相容性。细胞增殖实验和荧光染色发现，两种细胞在凝胶层上生长良好，表现出快速增殖的特点；巨噬细胞呈圆球状存在，表现出未激活的状态；MSCs则表现为纺锤状形貌，有明显伪足伸出。 将巨噬细胞与材料进行培养后，通过ELISA，流式细胞术（FACS）和聚合酶链式反应（PCR）评价了巨噬细胞表型的转变。结果发现，与载有因子的材料培养3天后巨噬细胞已极化为M1型，培养7天后M1型巨噬细胞已转变为M2型，而与不载因子的材料培养后巨噬细胞始终保持未极化状态（M0），这与IFN-γ和IL-4的释放行为一致。 综合所有实验结果，本研究制备得到的复合材料体系具有良好的生物相容性，且能在体外有效调节巨噬细胞表型由M1向M2顺序转变。因此，该材料体系可作为一种新型的免疫调节材料，用于研究机体组织与植入体间的免疫反应，该项研究也为硬组织替换材料的研发提供了新的思路和方向。

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