决明COTI1与COTI2在抗虫、干旱及盐胁迫的功能研究

摘要

决明（Cassia obtusifolia L）为一年生豆科植物，干燥成熟的种子被称为决明子，含有较高的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂。随着对决明功能基因的研究，已从决明种子中成功分离出Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因决明胰蛋白酶抑制剂基因1与决明胰蛋白酶抑制剂基因2（Cassia obtusifolia 1，COTI1 和Cassia obtusiflia 2，COTI2），通过体内、体外实验以及转基因拟南芥过表达进一步研究了目的基因的抗虫及抗逆性，为提高植物抗虫、抗逆方面的研究奠定基础。主要结果如下： 1）决明胰蛋白酶抑制剂1（COTI1）通过原核表达纯化，将纯化蛋白COTI1喂食菜青虫，发现喂食COTI1的幼虫比正常组幼虫生长缓慢，甚至出现死亡情况。通过转录组数据和RT-qPCR分析发现对照组和COTI1喂食组中肠中与消化解毒相关基因出现差异表达，对照组中肠消化解毒基因的RPKM值与相对表达量均明显高于COTI1喂食组，表明COTI1抑制了中肠消化解毒酶的活性，从而达到抗虫作用，这为后续植物抗虫以及抗虫生物制剂研究奠定了基础。 2）以已克隆出的决明胰蛋白酶抑制剂2（COTI2）基因全长序列（792bp）为基础，构建COTI2-pBI121真核表达载体，通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，扩大培养。花序浸染将COTI2转入拟南芥，经卡那霉素筛选后得到转COTI2基因阳性苗。 3）拟南芥苗移植于含100mM、150mM NaCl以及1%、2%PEG的1/2MS琼脂平板上胁迫生长，观察到转COTI2基因拟南芥生长状态比野生型生长得更为茁壮，总根长、侧根长以及侧根密度都明显优于野生型拟南芥。利用根系扫描分析仪WinRHIZO测定分析得出：干旱胁迫条件下，转基因拟南芥侧根长度为野生型的1.246倍；盐胁迫条件下，转基因是野生型的1.577倍。 其次，转COTI2基因拟南芥种子在2%、3%PEG胁迫下萌发率分别为53%与24%，野生型种子的萌发率为45%、11%；在100mM、150mM NaCl胁迫下，转COTI2基因拟南芥种子萌发率为84.7%与26.7%，而野生型拟南芥种子萌发率为76%与18%。由此可见，与野生型比较，转COTI2基因拟南芥种子在干旱和盐胁迫条件下，有更高的萌发率。 4）转COTI2基因苗与野生型苗移栽到营养土中培育，并用100mM、150mM NaCl和2%、3%PEG进行盐和干旱胁迫，100mM NaCl模拟盐胁迫8天后，测得转基因拟南芥的植株高度是野生型拟南芥的150%；150mM NaCl模拟盐胁迫4天后，转基因拟南芥的植株高度是野生型拟南芥的128%；采用2%PEG模拟干旱迫8天后，转基因的植株高度是野生型的111%；3%PEG模拟干旱胁迫4天后，转基因是野生型的114%。土培胁迫下，转COTI2基因拟南芥的植株高度明显高于野生型拟南芥植株，且生长状态更好。 同时，测得叶片相对含水量：100mM NaCl胁迫8天，转基因拟南芥的叶片相对含水量是野生型拟南芥的108%；150mM NaCl胁迫4天后，转基因是野生型的104%；2%PEG模拟干旱迫8天，转基因拟南芥的叶片相对含水量是野生型拟南芥的109%；3%PEG胁迫4天后，转基因是野生型的105%，转COTI2基因拟南芥的保水能力高于野生型。 5）RT-qPCR结果显示：COTI2基因在不同胁迫下出现差异表达，1%PEG胁迫时相对表达量最高，随后降低，而在盐胁迫时表达量随NaCl浓度的升高出现上升趋势。而相较于无胁迫时，COTI2在盐与干旱胁迫时均具有更高的相对表达量。 6）同时，测定不同胁迫时拟南芥粗蛋白对胰蛋白酶的抑制活性，结果显示无胁迫时转COTI2基因拟南芥蛋白的抑制活性比是野生型拟南芥的1.37倍，而干旱胁迫和盐胁迫时转基因粗蛋白的抑制活性比分别是野生型的2.54倍与1.80倍，转COTI2基因拟南芥粗蛋白对胰蛋白酶的抑制活性明显高出野生型拟南芥，表明COTI2蛋白对胰蛋白酶（EC3.4）等丝氨酸蛋白酶的活性有明显的抑制作用，在植株抗逆应激反应等方面有重要作用。 7）对胁迫处理后的拟南芥根系进行转录组测序分析，盐与干旱胁迫下，转COTI2基因拟南芥与野生型拟南芥中与抗逆相关的基因出现明显差异表达，其中转基因中的Hsp20、Hsf及R蛋白表达量在干旱胁迫下出现明显上调，提高了植物抗干旱的能力。同时，耐盐蛋白、谷胱甘肽S-转移酶以及Kunitz胰蛋白酶抑制剂在盐胁迫时的表达量也显著升高，提高了拟南芥植株的抗盐能力，表明转COTI2基因拟南芥相较于野生型具有更高的抗逆能力。 8）首次构建了真核表达载体COTI2-pYES2转入酿酒酵母BY4741，并筛选鉴定得到阳性克隆，成功将目的基因转入酵母表达系统，为后续蛋白功能研究奠定了基础。

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摘 要

第1章 绪论

1.1 决明简介

1.1.1 决明生物学特征

1.1.2 决明子的主要活性成分

1.2 胰蛋白酶抑制剂的研究进展

1.2.1 胰蛋白酶抑制剂简介

1.2.2 胰蛋白酶抑制剂分类

1.2.3 胰蛋白酶抑制剂的研究进展

1.3胰蛋白酶抑制剂的应用

1.3.1农业和养植方面的应用

1.3.2临床应用

1.4研究意义及内容

第2章 COTI1的抗虫效用及对中肠相关基因表达模式的影响

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 动物材料

2.1.3 其他试剂

2.2 试验方法

2.2.1 蛋白COTI1的表达

2.2.2 蛋白COTI1的纯化及浓度测定

2.2.3 COTI1蛋白对菜青虫生长发育的影响

2.2.4 COTI1蛋白对牛胰蛋白酶及中肠蛋白酶的抑制活性

2.2.5 中肠RNA提取及cDNA合成

2.2.6 特异性引物的设计

2.2.7 中肠消化解毒相关基因的RT-qPCR扩增

2.3 结果与讨论

2.3.1 蛋白COTI1的表达

2.3.2 蛋白COTI1的纯化及浓度测定

2.3.3 COTI1蛋白对菜青虫的生长发育及中肠酶的抑制

2.3.4 中肠组织RNA的提取

2.3.5 引物特异性检测

2.3.6 中肠相关基因表达模式分析

2.4 本章小结

第3章 转COTI2基因拟南芥的获得

3.1 实验材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 其他试剂及菌种

3.2 试验方法

3.2.1 重组真核表达载体的提取

3.2.2 重组农杆菌GV3101的构建

3.2.3 野生型拟南芥的种植

3.2.4 转染野生型拟南芥

3.2.5 转基因拟南芥阳性苗的筛选

3.3 结果与讨论

3.3.1 重组真核表达载体的提取与鉴定

3.3.2 重组农杆菌GV3101的构建

3.3.3 野生型拟南芥的种植

3.3.4 转基因拟南芥阳性苗的筛选

3.4 本章小结

第4章 拟南芥的萌发率和侧根生长情况

4.1 实验材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 其他试剂

4.2 试验方法

4.2.1 培养基的配置

4.2.2 种子的萌发

4.2.3 幼苗胁迫处理

4.2.4 表型观察以及根系分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 种子的萌发率

4.3.2 幼苗胁迫表型观察

4.3.3 胁迫条件下侧根分析

4.4 本章小结

第5章 拟南芥土培胁迫表型及叶片相对含水量

5.1 实验材料

5.1.1 植物材料

5.1.2 其他试剂

5.2 实验方法

5.2.1种子的春化及萌发

5.2.2 幼苗的移植培养

5.2.3 植株胁迫处理

5.2.4 拟南芥叶片相对含水量测定

5.3 结果与讨论

5.3.1 拟南芥盐胁迫表型分析

5.3.2 拟南芥干旱胁迫表型分析

5.3.3 拟南芥叶片的相对含水量

5.4 本章小结

第6章 COTI2基因在不同胁迫下表达模式

6.1 实验材料

6.1.1 植物材料

6.1.2 其他试剂

6.2 试验方法

6.2.1 拟南芥样本获取

6.2.2 RNA提取与cDNA的合成

6.2.3 特异性引物的设计与检测

6.2.4 拟南芥COTI2基因的RT-qPCR扩增

6.3 结果与讨论

6.3.1 转基因拟南芥RNA提取

6.3.2 特异性引物检测

6.3.3 COTI2基因的表达模式分析

6.4 本章小结

第7章 拟南芥蛋白抑制活性测定

7.1 实验材料

7.1.1 植物材料

7.1.2 其他试剂

7.2 试验方法

7.2.1 拟南芥叶片总蛋白的提取

7.2.2 蛋白浓度的测定

7.2.3 蛋白抑制活性的测定

7.3 结果与讨论

7.3.1 拟南芥粗蛋白浓度

7.3.2 拟南芥粗蛋白的抑制活性

7.4 本章小结

第8章 拟南芥的转录组分析

8.1 实验材料

8.1.1 植物材料

8.1.2 其他试剂

8.2 试验方法

8.2.1 样品的获取

8.2.2 转录组测序及分析

8.3 结果与讨论

8.3.1 干旱胁迫下转COTI2基因与野生型的差异表达基因

8.3.2 盐胁迫下转COTI2基因与野生型的差异表达基因

8.4 本章小结

第9章 COTI2酵母表达系统的构建

9.1 实验材料

9.1.1 实验试剂

9.1.2 菌种与质粒

结 论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文及科研成果