牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精及受精卵体外培养研究

摘要

本文主要对牛卵巢卵母细胞体外成熟、体外受精以及受精卵的不同体外发育条件进行研究，以探明胚胎体外生产部分环节的影响因素。 分别采用抽吸法、割破法采集卵巢表面卵母细胞，检验不同采集方法对卵巢卵母细胞数量和质量的影响。试验表明：抽吸法的回收率(86.19％)高于割破法(78.46％)，但二者无显著差异。割破法获得的A级卵母细胞数极显著高于抽吸法(p<0.01)，抽吸法获得的C级卵母细胞显著高于割破法(p<0.05)。 根据有无黄体将采集到的卵巢分为两种，各取20枚进行试验，观察有无黄体对卵母细胞数量和质量以及体外培养成熟率的影响。结果表明：有黄体的卵巢和无黄体的卵巢平均卵泡数分别为11个和20个，差异极显著(p<0.01)。在相同培养条件下，无黄体卵巢卵母细胞的成熟率为84.33％，显著高于有黄体卵巢卵母细胞的成熟率74.32％(p<0.05)，两种卵巢收集到的可用卵母细胞比率(A、B级卵母细胞占总数的百分比)差异不显著。 以TCM-199为基础培养液，分别添加10％NCS(对照组)，10％NCS+10％BFF(第1组)，10％NCS+20％BFF(第2组)，10％NCS+30％BFF(第3组)，10％NCS+40％BFF(第4组)，10％BFF(第5组)，20％BFF(第6组)，30％BFF(第7组)，观察自制NCS和BFF对卵母细胞体外成熟培养影响。结果表明：第2组卵母细胞的成熟率为84.93％，与对照组(65.08％)相比，差异极显著(p<0.01)。当与NCS一起添加，卵泡液添加剂量超过20％时，其成熟率与卵泡液添加剂量成负相关。单独添加卵泡液，剂量超过20％时，成熟率也呈下降趋势。 采用割破法采集卵巢表面2-6mm卵泡卵母细胞和用切割法采取卵巢深层卵母细胞进行IVM、IVC比较，两者的成熟率分别为58.20％和55.84％，差异不显著。位于卵巢表面卵泡的卵母细胞体外受精后的卵裂率为 54.76％，高于卵巢深层卵母细胞的卵裂率(48.53％)，但二者差异不显著。 将体外受精卵与输卵管上皮细胞、卵丘细胞共同培养，并将其分成第1组(IVM、IVC时添加输卵管上皮细胞和卵丘细胞)；第2组(IVM时添加卵丘细胞、IVC时添加输卵管上皮细胞)；第3组(IVM、IVC时添加输卵管上皮细胞)； 第4组(IVM、IVC时添加卵丘细胞)；对照组不添加细胞。结果表明：第2组的成熟率、卵裂率和囊胚发育率分别为85.90％、65.38％、42.31％，极显著高于(p<0.01)对照组(52.38％、34.92％、19.05％)，且其成熟率也显著高于第3组(p<0.05)，第2组的卵裂率和囊胚发育率与第4组差异显著(p<0.05)。对照组的卵裂率和囊胚发育率明显低于第3组(p<0.05)。试验结果表明，在牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精及受精卵体外培养研究中，割破法可以得到更多的可用卵母细胞；无黄体的卵巢卵母细胞体外成熟效果优于有黄体的卵巢卵母细胞；卵巢深层的卵母细胞体外成熟率和受精后卵裂率与卵巢表面卵泡卵母细胞无明显差异；成熟培养液中添加10％NCS+20％BFF能显著提高卵母细胞的成熟率；卵丘细胞对卵母细胞成熟有促进作用，输卵管上皮细胞可以促进受精卵的分裂，在IVM时添加卵丘细胞、IVC时添加输卵管上皮细胞是比较理想的培养系统。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

1前言

1.1卵母细胞体外受精的研究历史

1.2卵母细胞的体外成熟

1.2.1卵母细胞的来源和采集方法

1.2.2卵母细胞成熟培养液

1.2.3培养时间

1.2.4成熟培养的环境条件

1.3卵母细胞的体外成熟的影响因素

1.4体外受精

1.4.1精子的获能及处理

1.4.2体外受精系统

1.5早期胚胎的体外培养

1.5.1发育阻断

1.5.2早期胚胎的体外培养系统

1.6目的和意义

2试验材料和方法

2.1试验材料

2.1.1卵巢和精液

2.1.2主要试验药品及试剂

2.1.3主要仪器

2.2试验方法

2.2.1卵母细胞的回收

2.2.2卵母细胞的体外成熟培养

2.2.3共同培养系统的准备

2.2.4培养条件

2.2.5成熟卵母细胞的体外受精

2.2.6胚胎的体外培养

2.2.7溶液的配制

2.3试验设计

3结果与分析

3.1抽吸法、割破法对采集卵母细胞的数量和质量的影响

3.2卵巢上有无黄体对卵母细胞成熟率的影响

3.3不同成熟培养液对卵母细胞体外成熟的影响

3.4卵巢表面2-6mm卵泡卵母细胞与深层卵母IVM、IVC的效果比较

3.5细胞共同培养对体外受精胚胎培养分裂率的影响

4讨论

4.1采集方法对卵母细胞的数量和质量的影响

4.2卵母细胞来源对IVMFC的影响

4.3不同成熟培养液对卵母细胞体外成熟的影响

4.4输卵管上皮细胞共同培养对体外受精胚胎培养分裂率的影响

5结论

参考文献

致谢

附录

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