幼鲤硒缺乏症及其机制和硒需要量研究

摘要

本研究采用纯合日粮，系统研究了幼鲤硒的缺乏症、需要量；系统研究了幼鲤硒缺乏情况下，自由基、抗氧化酶系统、肝细胞凋亡之间的关系；系统研究了硒缺乏与免疫的关系；从分子水平研究了不同水平硒对幼鲤类胰岛素样生长因子(IGF-I)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)基因表达的影响。研究包括四个试验： 试验一：选择体重12.6±0.8克的健康幼鲤360尾，随机分为4组，饲喂分别添加硒(以亚硒酸钠形式，AR)0、0.15、0.30、0.45mg/kg硒的4种饵料，经30周试验，对幼鲤硒缺乏进行了系统的组织病理学、血液学的研究。结果表明：幼鲤硒缺乏会导致发病和死亡，且与饵料中硒含量呈负相关，各组发病率分别为46.7％、33.3％、13.3％和0；死亡率分别为26.7％、16.7％、6.7％和0；病鱼表现特征性的“瘦背病”和脊柱弯曲症状。病理剖解，可见背部两侧肌肉萎缩变薄，呈刀刃状，体侧红肌纤维退色变白；肝脏和脾脏肿大、充血、出血。组织学上，最突出的变化表现为营养性肌病、营养性肝病、胰腺的变性、坏死等；骨骼肌纤维变性、坏死，残存的肌纤维萎缩变细；心肌纤维细胞肿胀、变性，肝细胞变性、坏死，甚至发生溶解消失；胰腺腺泡变性、坏死；脾脏出血，淋巴细胞大量减少，巨噬细胞增多形成黑素巨噬细胞中心；肾小管上皮细胞肿胀、变性；神经元细胞肿胀，变性，偶尔可见噬神经现象的出现。超微结构上，表现为骨骼肌纤维、肝细胞和肾小管上皮细胞线粒体肿胀，嵴断裂，甚至发生溶解，整个线粒体囊泡化；脾脏细胞出现广泛性的充血，水肿；淋巴细胞坏死。血液学上，红细胞数量、血红蛋白含量和IgM抗体水平都降低，白细胞数量和红细胞脆性增加，血清丙二醛(MDA)含量升高；幼鲤血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)活性升高，而谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物酶歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性降低。 试验二：选择体重15.5±0.7克的健康幼鲤270尾，随机分为3组，饲喂分别添加硒(以亚硒酸钠形式，AR)0、0.25、0.50mg/kg的3种不同饵料，试验期16周。分别于试验第4、8、16周，采血和取肝脏进行N0、NOS测定和肝细胞凋亡检测。结果表明：硒缺乏可导致幼鲤血清和肝脏中NOS活性显著增强，NO含量显著升高(P(0.05)。硒缺乏可导致幼鲤肝细胞凋亡，其特征表现为肝细胞染色质浓缩，边移，呈半月状，在浓缩的基础上发生裂解，呈大小不等的小团块，并可见凋亡细胞形成具有特征性的、质膜完整的凋亡小体。随着试验时间的延长，肝细胞凋亡率增高。幼鲤硒缺乏导致肝细胞的凋亡由N0介导。 试验三：选择体重10.4±0.4克的健康幼鲤1200尾，随机分为10组，每组3个重复，每个重复40尾，分别饲喂添加硒(以亚硒酸钠形式，AR)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9 mg/kg的10种不同饵料，试验期90d。结果表明：随着饵料中硒添加水平的增加，幼鲤的增重和成活率提高，饵料系数降低，添加硒0.4mg/kg时，幼鲤生长性能最佳(P(0.05)；添加0.3～0.5 mg/kg硒，可显著提高幼鲤头肾和脾脏重及其体指数(P<0.05)，增加血液红细胞数量，降低白细胞数量，提高血清IgM水平和攻毒后成活率、血清溶菌酶活力及血清凝集抗体效价(P<0.05)，从而增强幼鲤免疫功能和对疾病的抵抗力；同时，显著提高血清和肝脏中GPx活力(P<0.05)；血清和组织的硒含量(P<0.05)。幼鲤体增重、饵料系数、头肾重量、脾脏重量、血清溶菌酶活力和IgM抗体水平与饵料硒添加量呈显著的二次曲线相关。根据上述指标确定的最适硒需要量为0.434～0.517mg/kg(分别为0.517、0.499、0.434、0.447、0.480、0.464mg/kg)。 试验四：选择体重15.3±0.8克的健康幼鲤160尾，随机分为4组，每组2个重复，每个重复20尾，分别饲喂添加硒(以亚硒酸钠形式，AR)0、0.15、0.30和0.45mg/kg的4种不同饵料，试验期8周。采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对肝脏中的IGF-I和GPx mRNA的表达进行测定。结果表明：饵料中添加硒对肝脏的IGF-I和GPxmRNA的表达有促进作用；随着饵料硒水平的提高，IGF-I和GPX mRNA的表达量也呈显著增加趋势(P(0.05)。

目录

论文说明：缩略语表

声明

前 言

第一部分文献综述

1硒的理化性质

2硒在动物体内的分布与代谢

2.1硒在动物体内的分布及其形式存在

2.2硒在动物体内代谢

3硒在动物体内的生物学功能

3.1硒对NO自由基代谢的影响和抗氧化功能

3.2硒对机体免疫功能的影响

3.3硒的其它生物学功能

4.细胞凋亡与硒

4.1细胞凋亡的形态特征

4.2调控细胞凋亡的基因与特点

4.3细胞凋亡的生理与病理学意义

4.4细胞调亡的检测方法

4.5NO自由基与细胞凋亡

4.6硒对细胞凋亡的影响

5.硒蛋白基因表达的调控

5.1饲粮硒水平

5.2其他因素的调节

6硒与鱼类营养

6.1硒在鱼类营养中的作用

6.2鱼类硒缺乏的研究

6.3鱼类硒中毒的研究

6.4鱼对不同来源硒的生物利用率

6.5鱼对硒的需要量

7微量元素需要量的研究方法

7.1析因法

7.2添加饲养试验

7.3平衡试验

8存在的问题、本研究的目的、内容、意义

8.1存在的问题

8.2研究目的

8.3研究内容

8.4研究意义

第二部分试验研究

试验一幼鲤硒缺乏症的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

试验二硒缺乏对NO自由基代谢和诱导肝细胞凋亡的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

试验三幼鲤硒需要量的研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

试验四不同硒水平对幼鲤肝脏IGF-1和GPx基因表达的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

第三部分总体讨论与结论

1总体讨论

1.1幼鲤缺硒的病理学变化

1.2硒缺乏对幼鲤肝脏NOS活性、NO含量和细胞凋亡的影响

1.3幼鲤对硒的需要量与硒促生长的机制

1.4硒对肝脏GPx及其基因表达的影响

2全文结论

3本研究的创新点

4有待进一步研究的问题

参考文献

致谢

附图

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