鸭肝炎病毒人工感染雏鸭病理发展规律及免疫组化与免疫荧光检测病原侵染规律的研究

摘要

本文围绕鸭肝炎病毒分离鉴定、人工感染疾病模型病理学、抗原定位的免疫组化(荧光)方法及其病毒侵染感染鸭组织规律等开展系列研究：①爆发流行鸭病毒性肝炎病毒分离鉴定；②鸭病毒性肝炎病毒人工感染鸭病理学发展规律研究；③检测石蜡切片中鸭病毒性肝炎病毒的免疫组化、免疫荧光方法建立及其病毒侵染感染鸭组织在抗原定位的应用。获得如下结果： 1．爆发流行鸭病毒性肝炎病毒分离鉴定：2006年四川成都、西昌等地爆发流行具有鸭病毒性肝炎(DVH)典型临床症状和病变的传染病，从间接免疫荧光检测呈阳性的病死鸭肝脏分离到3株(CD、HB、XC)病毒，电镜下病毒颗粒呈圆形、无囊膜，直径30-40 nm，对氯仿、pH3.0℃、50℃ 60 min的处理不敏感，分离毒连续传代3次，全部鸭胚在24-60 h死亡，胚体呈弥散性充血、出血，其致死鸭胚的能力能够被Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV)高免血清中和。分离毒人工感染1日龄雏鸭后出现与自然病例相同的临床症状和病理变化，并能重新分离到相同病毒。间接免疫组化检测自然病例和人工感染雏鸭的肝、脾、肾等均出现阳性结果。结果表明分离到的3株病毒均为Ⅰ型DHV，为DVH有效预防提供了有用的实验数据。 2．鸭病毒性肝炎病毒人工感染鸭病理学发展规律研究：本研究采用肌注、口服和滴鼻3种途径感染1日龄雏鸭DHV-XC，成功复制了鸭病毒性肝炎的病理模型。3种感染途经的雏鸭均出现以下病变：肝脏在早期发生出血性坏死性肝炎，后期呈现胆管增生性病变；肾小管上皮细胞坏死及异假嗜伊红白细胞浸润；脾脏组织充血出血及淋巴细胞坏死；胰组织也出现胰腺细胞的局灶性坏死及嗜酸性染色，并且出现炎性细胞浸润；心脏心肌细胞的空泡变性及弥散出血；胸腺和法氏囊的淋巴细胞的坏死；接种后各时期脑组织呈现毛细血管充血；肠道和哈氏腺毛细血管充血和部分粘膜上皮的脱落。 3．检测石蜡切片中鸭病毒性肝炎病毒的免疫组化、免疫荧光方法建立及其病毒侵染感染鸭组织在抗原定位的应用 ①检测石蜡切片中鸭病毒性肝炎病毒的免疫组化方法建立及其病毒侵染感染鸭组织在抗原定位的应用：以蔗糖密度梯度离心提纯的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)免疫兔制备兔抗DHV-Ⅰ抗体，建立了间接免疫酶染色(ⅡS)检测石蜡组织切片中的DHV-Ⅰ抗原的方法。结果表明建立的ⅡS与DHV-Ⅰ感染死亡或濒死雏鸭的肝脏等出现阳性反应，与鸭瘟病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌感染发病和死亡雏鸭的肝脏以及健康雏鸭的肝脏出现阴性反应。感染雏鸭机体内病毒抗原的动态分布结果，间接免疫过氧化物酶染色检测DHV结果表明：接种12 h后不同时间，在肝脏、脾脏、肾脏、胰脏、胸腺、肠道、肌肉和法氏囊组织中3个攻毒组均可检测到鸭肝炎病毒抗原，而部分死亡或濒临死亡的雏鸭肺脏、心脏、脑组织中检测到病毒抗原。病毒抗原均位于阳性细胞的细胞质中。经ⅡS检出的时间顺序，肌注组：肝脏、脾脏>肾脏、十二指肠>胰腺、肌肉、空肠>心脏、胸腺、法氏囊、哈氏腺、回肠、盲肠、直肠>肺、脑；口服组：肝脏>脾脏、肾脏>胰腺、胸腺、哈氏腺、法氏囊、肌肉、十二指肠、空肠、回肠、直肠>盲肠>心脏、肺脏>脑；滴鼻组：肝脏>脾脏、肾脏、肺脏>胰腺、法氏囊、十二指肠、空肠>胸腺、哈氏腺、肌肉、回肠、盲肠、直肠>心脏、脑。 ②检测石蜡切片中鸭病毒性肝炎病毒的免疫荧光方法建立及其病毒侵染感染鸭组织在抗原定位的应用：间接免疫荧光检测DHV的结果与间接免疫过氧化物酶染色检测DHV结果相似，只是存在个体上的差异。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

本论文的创新性研究工作

1前言

1.1历史与分布

1.2病原特征

1.3致病特征

1.4症状与病变

1.5病理变化与病毒分布的关系

1.6诊断与检测方法

1.7免疫组化方法的简介

1.8本研究的切入点及拟解决的问题

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1试验毒株

2.1.2病料

2.1.3参考毒(菌)株

2.1.4试验动物

2.1.5试验用试剂

2.1.6试验仪器

2.2兔抗DHV高免血清的制备及其IgG提取

2.2.1 DHV抗原的制备

2.2.2兔抗DHV血清的制备

2.3.3用辛酸-硫酸铵纯化兔抗DHV-IgG

2.2.4用high-Q纯化兔抗DHV-IgG

2.2.5 IgG的鉴定

2.3间接免疫酶染色检测DHV方法的建立及优化

2.3.1间接免疫酶染色优化的条件的筛选

2.3.2间接免疫酶染色方法的染色程序

2.3.3读片标准

2.3.4特异性试验

2.3.5对临床样品的检测

2.4间接免疫荧光检测DHV方法的建立及优化

2.4.1间接免疫荧光检测优化条件的筛选

2.4.2间接免疫荧光染色程序的确定

2.4.3结果的判定标准

2.4.4特异性试验

2.4.5对临床样品的检测

2.5爆发鸭病毒性肝炎病原的分离鉴定

2.5.1病料处理

2.5.2鸭胚接种及病毒收获

2.5.3分离病毒理化特性测定

2.5.4分离病毒电镜观察

2.5.5分离病毒动物回归试验

2.5.6分离病毒感染雏鸭和自然病例的间接免疫组化检测

2.6鸭肝炎病毒感染雏鸭的病理学观察

2.6.1病理模型的复制

2.6.2采取样品及样品的制备

2.6.3切片的制作

2.6.4苏木素伊红染色

2.6.5观察和记录

2.7鸭肝炎病毒感染雏鸭组织内病毒分布的动态观察

2.7.1病理模型复制及样品制备

2.7.2间接免疫酶染色检测雏鸭组织内病毒动态分布

2.7.3间接免疫荧光检测雏鸭组织内病毒动态分布

3结果与分析

3.1兔抗DHV抗体的制备和纯化

3.1.1 DHV的增殖与纯化

3.1.2兔抗DHV抗体的制备及纯化

3.2免疫组化检测DHV-Ⅰ抗原的建立和优化

3.2.1间接免疫过氧化物酶染色程序

3.2.2特异性试验

3.2.3对临床样品的检测

3.3间接免疫荧光检测DHV的建立及优化

3.3.1间接免疫荧光检测DHV的程序

3.3.2特异性试验

3.3.3对临床样品的检测

3.4爆发鸭病毒性肝炎病原的分离鉴定

3.4.1病毒的分离

3.4.2中和实验

3.4.3理化特性

3.4.4电镜观察

3.4.5动物感染试验

3.4.6间接免疫组化检测

3.5鸭肝炎病毒感染雏鸭的病理学观察

3.5.1人工感染鸭肝炎强毒的临床症状

3.5.2人工感染鸭肝炎强毒的大体病变

3.5.3人工感染鸭肝炎强毒的组织病理学变化

3.6鸭肝炎病毒感染雏鸭组织内病毒定位及动态分布

3.6.1不同途经感染雏鸭组织内病毒的定位及动态分布间接免疫过氧化物酶染色检测结果

3.6.2不同途经感染雏鸭组织内病毒的定位及动态分布间接免疫荧光检测结果

3.6.3间接过氧化物酶染色与间接免疫荧光检测DHV-Ⅰ在雏鸭组织分布的比较

4讨论

4.1病毒的纯化与抗体的制备

4.2间接过氧化物酶染色检测DHV方法的建立及意义

4.2.1免疫组化方法的建立与优化

4.2.2免疫组化的特异性

4.2.3免疫组化与其他诊断检测DHV-Ⅰ方法的比较及其意义

4.3间接免疫荧光检测DHV方法的建立及意义

4.3.1间接免疫组化检测DHV方法的建立与优化

4.3.2间接免疫荧光与其他诊断检测DHV-Ⅰ方法的比较及其意义

4.4关于鸭肝炎病毒的分离鉴定

4.5感染DHV病理模型的病理学发展规律与病毒致病关系的探讨

4.5.1鸭肝炎病毒感染雏鸭的肝脏的组织病理变化的动态观察

4.5.2鸭肝炎病毒感染雏鸭的肾脏的组织病理变化的动态观察

4.5.3关于胰腺病变的探讨

4.5.4免疫系统病变与致病性的关系

4.5.5脑组织病变的探讨

4.5.6肠道病变的特点

4.6感染DHV病毒分布规律与病毒致病关系的探讨

4.6.1不同接种途径DHV在雏鸭体内分布规律的比较及其意义

4.6.2 DHV-Ⅰ在组织器官的分布特点与病毒特性的关系

4.7组织病理变化、病毒分布特征与病毒致病性三者之间的关系

5结论

参考文献

致谢

附图1

附图2

攻读学位期间发表的学术论文目录