小鹅瘟VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v和Ag10v研制及免疫原性研究

摘要

基于当前小鹅瘟亚单位蛋白疫苗的研究尚属空白，本文通过对小鹅瘟病毒衣壳蛋白VP3基因的生物信息学分析，设计并制备了源于VP3基因重要抗原表位区域的两个基因工程重组亚单位疫苗(Ag16v和Ag10v)，并将该疫苗应用于对青年鹅和种鹅的免疫原性研究。具体结果如下： 1.小鹅瘟病毒VP3基因抗原表位分析进行生物信息学分析及其16个抗原决定簇片段(Ag16)和10个抗原决定簇片段(Ag10)的扩增、克隆 生物信息学分析预测VP3基因可能存在两个主要抗原表位，即16个抗原决定簇(位于106-1422bp)和10个抗原决定簇(位于106-774bp)，分别命名为Ag16和Ag10，经PCR扩增后成功克隆于pMD-18-T，获得pMD-18-T-Ag16和pMD-18-T-Ag10，经酶切和测序鉴定正确。 2.小鹅瘟病毒VP3基因Ag16和Ag10抗原决定簇片段的原核表达和产物纯化 pMD-18-T-Ag16和pMD-18-T-Ag10与pET-32a(+)连接后分别获得原核表达载体pET-32a(+)-Ag16和pET-32(+)-Ag10，转化。Rosseta(DE3)后可高效表达，Westernblotting证实表达产物可被兔抗GPV血清有效识别，具有良好免疫反应性。表达蛋白以包涵体形式存在，经包涵体洗涤和镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白Ag16和Ag10。 3.小鹅瘟病毒VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v和Ag10v对青年鹅免疫原性研究 将获得的纯化重组蛋白Ag16和Ag10分别与等体积完全弗氏佐剂混合，乳化成终浓度为1mg/mL的基因工程重组亚单位疫苗Ag16v和Ag10v。将80只28日龄鹅平均分成8组，编号A、B、C、D、E、F、G、H，将Ag16v以0.125mg/只，0.25mg/只，0.5mg/只分别皮下免疫到A、B、c组青年鹅；将Ag10v以0.125mg/只，0.25mg/只，0.5mg/只分别皮下免疫到D、E、F组青年鹅；并设立1羽份/只的弱毒免疫对照G组和0.5ml0.02MPBS/只皮下免疫对照组H组。于免疫后3d，7d，14d，21d，35d，49d，63d，77d，91d，105d，119d，133d，147d，161d，175d采血，3-49d采血做MTT淋巴细胞转化试验，3-175d做间接ELISA法测定血清IgG抗体滴度和中和抗体实验。MTT结果显示，不同免疫剂量的Ag16v和Ag10v均能有效的刺激机体产生细胞免疫应答，显著(P＜0.05)高于PBS对照组，但低于(P＜0.05，P＜0.01)弱毒对照组。ELISA检测IgG抗体的OD450值结果发现，不同免疫剂量的Ag16v和Ag10v均能刺激青年鹅机体产生体液免疫应答，于28d时其OD450值达到峰值，极显著(P＜0.01)高于PBS对照组，但弱毒对照组的青年鹅于35d时达到峰值，其峰值与两基因工程重组亚单位疫苗峰值基本相当。中和抗体试验测定结果显示，Ag16v和Ag10v均能有效的刺激青年鹅机体产生高效价的中和抗体，于7d开始检出中和抗体，至35d时其中和抗体达到峰值，而PBS对照组未检出其血清中有中和抗体，弱毒免疫的对照组青年鹅血清中和抗体峰值出现于49d，峰值大小与Ag16v、Ag10v免疫组峰值基本相当。从免疫效果(包括MTT、ELISAOD值、中和抗体效价)与免疫剂量的关系分析，Ag16v和Ag10v各免疫组均表现为，高剂量组高于中剂量组，中剂量组高于低剂量组，说明Ag16v和Ag10v的免疫效果存在剂量相关性。将同等剂量的Ag16v和Ag10v刺激青年鹅机体产生的免疫效果进行比较发现，Ag10v免疫组在大多时间点上，显著或极显著(P＜0.05，P＜0.01)高于Ag16v免疫组，这可能与单位质量的抗原蛋白内，Ag10v含抗原决定簇数目较Ag16v更高有关，同时也提示我们，在选择基因工程重组亚单位疫苗的抗原时，有必要考虑该段蛋白的大小和抗原决定簇密度的关系，从而设计出更为合理、更高效率的亚单位疫苗。 4.小鹅瘟病毒VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v和Ag10v对种鹅免疫原性研究 取初产种母鹅200只，平均分成4组，编号A、B、C、D，取种公鹅50只平均分配到4组混养。将Ag16v以0.5mg/只皮下免疫A组种鹅，Ag10v以0.5mg/只皮下免疫D组种鹅，弱毒1羽份/只皮下免疫B组种鹅，0.02MPBS0.5ml/只皮下免疫C组种鹅。于免疫后3d、7d、14d、21d、28d、35d、49d、63d、77d、91d、105d、119d、133d、147d、161d、175d随机每组采血10只测定血清IgG和中和抗体，并取种蛋，每组随机取5枚用于卵黄抗体EIASA测定和中和抗体测定，其余孵化成雏鹅，而后随机每次每组取10只于1日龄口服小鹅瘟强毒，记录死亡情况，并于7日龄全部安乐处死，取肝、十二指肠、直肠做切片镜检，统计保护率。ELISA测定OD450值结果显示，Ag16v和Ag10v免疫的种鹅血清IgG抗体OD450值大幅上升，28d达峰值，175d仍维持较高水平，所产种蛋均含有较高的IgG抗体，至35d达到峰值，显著高于对照PBS组，弱毒免疫组的种鹅所产种蛋也含有较高的IgG抗体，且至49d时达到峰值，与Ag16v和Ag10v峰值大小相当。中和抗体测定试验结果显示，Ag16v和Ag10v免疫的种鹅于免疫后7d检出血清中和抗体，35d升至最高，175d仍维持较高水平，在免疫14d后开始检出卵黄中和抗体，并于35d达到峰值，而弱毒免疫组的种鹅的峰值出现在49d，其大小与Ag16v相当，极显著(P＜0.01)低于Ag10v，PBS免疫组种鹅所产种蛋未检出中和抗体。攻毒试验结果显示，Ag10v免疫的种鹅21d后其后代开始出现90％较高保护率，而Ag16v、Ag10v和弱毒免疫种鹅28d后首次出现100％的保护率，Ag16v组和Ag10v组的100％保护率一直持续到种鹅免疫后的147d，弱毒组的100％保护率持续到种鹅免疫后的161d，PBS免疫的种鹅后各时间点的后代未检测到保护率。 通过对青年鹅和种鹅的免疫效果评价结果表明，本研究所研制的两基因工程重组亚单位疫苗Ag16v和Ag10v均具有良好的免疫原性。在青年鹅体的试验中表明，Ag16v和Ag10v产生的细胞免疫应答效果显著的低于弱毒疫苗，但在体液免疫应答、中和抗体效价方面，Ag16v略低于弱毒，而Ag10v高于弱毒，推测这可能与Ag10v抗原决定簇较Ag16v更为集中有关，同时，不同剂量的Ag16v和Ag10v免疫结果显示，两疫苗的免疫效果均存在一定的剂量相关性。采取青年鹅体试验的最佳免疫剂量0.5mg/只将两疫苗免疫种鹅结果表明，Ag16v和Ag10v免疫的种鹅血清及所产种蛋均有高水平的卵黄抗体IgG和中和抗体，并能为雏鹅提供近5个月对小鹅瘟强毒100％的保护力，这一结果与对照弱毒的免疫结果相当。Ag16v和Ag10v较弱毒具有无潜在危险、方便运输等优势，因此，其比弱毒疫苗具有更强的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

本论文的创新性研究工作

第一章鹅细小病毒及其分子生物学研究进展

1 GPV及鹅细小病毒病

1.2小鹅瘟分子生物学研究

2鹅细小病毒VP3基因的研究进展

2.1 不同株小鹅瘟病毒VP3基因同源性研究

2.2小鹅瘟病毒诊断方法的研究

2.3小鹅瘟病毒VP3基因的体外表达

3 选题目的和意义

第二章小鹅瘟病毒CHv-1株VP3基因的生物信息学分析

1 数据和方法

2结果

2.1同源性和进化树分析

2.2二级结构，疏水性，抗原决定簇以及表面抗原的预测

2.3磷酸化位点及N-糖基化位点的预测

2.4抗原决定簇的预测

3讨论

第三章Ag16和Ag10的原核表达，纯化及活性检测

1材料

1.1菌株/质粒

1.2主要试剂及配制

1.3主要仪器设备

1.4其他

2实验方法

2.1引物设计

2.2 Ag16和Ag10的PCR扩增

2.3 Ag16和Ag10的T-载体克隆与鉴定

2.4 Ag16和Ag10重组表达菌株的构建

2.5重组表达质粒的小量诱导表达

2.6重组质粒表达条件的优化

2.7 Western Blotting检测表达蛋白的免疫反应原性

2.8重组表达蛋白在宿主菌中的分布

2.9重组蛋白的纯化

3结果

3.1 Ag16和Ag10的扩增以及PET-32a(+)-Ag16和PET-32a(+)-Ag10原核表达载体的构建

3.2重组蛋白Ag16和Ag10在大肠杆菌(E.coli RosettaTM)中的表达

3.3重组质粒表达条件的优化

3.4 Western blotting检测表达蛋白的免疫反应原性

3.5重组表达蛋白在宿主菌中的分布

3.6重组蛋白的纯化

4.讨论

4.1关于大肠杆菌表达

4.2关于分段表达

第四章基因工程亚重组单位疫苗Ag16v和Ag10v对青年鹅免疫原性的研究

1材料

1.1 蛋白/佐剂/病毒

1.2动物

1.3 MTT相关溶液的配制

1.4 ELISA相关溶液的配制

1.5中和抗体相关试验材料

1.6主要仪器

2实验方法

2.1 Ag16v和Ag10v的制备

2.2 青年鹅的免疫

2.3淋巴细胞转化试验

2.4间接ELISA法检测免疫鹅外周血抗体水平

2.5 中和抗体试验

3结果及分析

3.1疫苗免疫青年鹅后的实验结果

3.2外周血T淋巴细胞转化效果

3.3血清抗体IgG的动态变化

3.4血清中和抗体动态变化

4 讨论

4.1 Ag16v和Ag10v免疫后，诱导青年鹅所产生的细胞免疫应答

4.2 Ag16v和Ag10v免疫后，诱导青年鹅所产生的体液免疫应答

4.3 Ag16v和Ag10v免疫后，诱导青年鹅所产生的免疫应答比较

4.4 Ag16v和Ag10v免疫与GPV弱毒免疫后，诱导青年鹅所产生的免疫应答的比较

4.5基因工程重组亚单位蛋白疫苗免疫动物的剂量

4.6 Ag16v和Ag10v良好免疫原性对小鹅瘟防治的意义和展望

第五章 Ag16v对种鹅的免疫及其免疫效果的评价

1 材料

1.1疫苗/病毒

1.2动物

1.3 ELISA相关溶液

1.4病理切片相关溶液的配制

1.5主要仪器

1.6其他

2方法

2.1种鹅的免疫

2.2种鹅血清抗体测定

2.3卵黄抗体的测定

2.4雏鹅的孵化

2.5雏鹅攻毒保护

2.6组织切片的制作

2.7保护率的计算方法

2.8数据分析

3 结果及分析

3.1种鹅的免疫结果

3.2种鹅血清抗体IgG动态变化

3.3种鹅血清中和抗体动态变化

3.4卵黄抗体IgG的动态变化

3.5卵黄中和抗体动态变化

3.6雏鹅的攻毒保护结果

4讨论

4.1小鹅瘟防治免疫方案的设计

4.2 Ag16v诱导种鹅卵黄抗体动态变化和其后代对小鹅瘟的抵抗力

4.3种鹅免疫Ag16v和弱毒苗的效果比较

第六章Ag10v对种鹅的免疫及其免疫效果的评价

1材料

1.1疫苗/病毒

1.2动物

1.3病毒分离相关材料

1.4间接ELISA法和中和抗体试验相关溶液

1.5病理切片相关溶液的配制

1.6主要仪器

1.7其他

2方法

2.1种鹅的免疫

2.2种鹅血清抗体的测定

2.3卵黄抗体的测定

2.4雏鹅的孵化

2.5雏鹅攻毒保护

2.6病毒的分离

2.7组织切片的制作

2.8保护率的计算方法

2.9数据分析

3结果

3.1种鹅免疫结果

3.2 种鹅血清抗体检测结果

3.3卵黄抗体

3.4雏鹅攻毒保护试验结果

3.5 Ag16v和Ag10v对种鹅免疫效果比较

4讨论

4.1 Ag10v诱导种鹅血清抗体和卵黄抗体动态变化及其后代对小鹅瘟的抵抗力

4.2 Ag10v和GPV弱毒对种鹅免疫效果的比较

4.3 Ag10v和Ag16v对种鹅免疫效果的比较

4.4母源抗体在新生动物对疾病抵抗中的利弊关系与小鹅瘟的防治

结论

参考文献

附录 主要试剂的配置

附表

附图

致谢

作者简介