鸭源巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌二联蜂胶疫苗的研制及其免疫应答反应的动态研究

摘要

本研究选用从四川某养殖场分离的两株鸭金黄色葡萄球菌DS12、DS13和三株鸭多杀性巴氏杆菌D22、D23和D157为制苗菌株，采用固体表面培养法，以蜂胶为免疫佐剂，制备鸭巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌二联蜂胶灭活疫苗。该疫苗物理性状符合疫苗制作的基本要求，经安全性检验证明其安全可靠；通过筛选确定了该疫苗的最佳免疫剂量为5×109CFU/mL，0.5ml/只，4℃可保存12个月以上。 本研究建立了检测鸭金黄色葡萄球菌抗体和鸭巴氏杆菌抗体的间接ELISA方法，对制备的鸭巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌(P.multocide-S.aureus)二联蜂胶灭活疫苗的体液免疫应答进行研究。采用鸭巴氏杆菌、葡萄球菌全菌裂解抗原为包被抗原，建立检测P.multocide-S.aureus二联蜂胶灭活疫苗免疫后的鸭血清中特异性抗体的ELISA方法。确定了金黄色葡萄球菌抗原最佳包被浓度：DS12最佳包被浓度为5.5μg/mL，DS13最佳包被浓度为6.25μg/mL；巴氏杆菌抗原最佳包被浓度：D22最佳包被浓度为11μg/mL，D23最佳包被浓度为17μg/mL，D157最佳包被浓度为16μg/mL。酶标羊抗鸭IgG的最佳浓度为0.125μg/mL。经交叉试验，重复性试验证实建立的ELISA重复性好、特异性强。板内变异系数分别为1.71％-4.06％(金黄色葡萄球菌)、1.93％-3.55％(巴氏杆菌)，板间变异系数分别为1.82％-4.18％(金黄色葡萄球菌)、1.96％-4.75％(巴氏杆菌)。包被金黄色葡萄球菌抗原建立的间接ELISA方法的灵敏度是微量凝集试验的50-100倍，包被巴氏杆菌抗原建立的间接ELISA方法的灵敏度是微量凝集试验的50-100倍。 应用建立的ELISA方法对该疫苗的体液免疫应答进行研究。结果表明，注射了P.multocide-S.aureus二联蜂胶灭活疫苗后，试验鸭在第3d开始产生免疫力，P.multocide和S.aureus共5株菌的抗体水平随着时间的延长逐渐升高，并在免疫后26d左右达到抗体最高水平，然后逐渐下降，免疫后75d的抗体水平与免疫后两周的抗体水平相当。且在免疫后的3-75d，一次免疫组的特异性抗体水平极显著高于生理盐水对照组(P＜0.01)，二次免疫组的特异性抗体水平于一次免疫后9d开始显著高于一次免疫组(P＜0.05)，于12-75d极显著高于一次免疫组(P＜0.01)。 攻毒保护试验结果表明，该疫苗对巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌同源菌株的攻击有保护力，一次免疫后14d，对巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌的保护率分别为90％和70％，二次免疫后14d，对巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌的保护率分别为100％和80％。 采用MTT比色法对T淋巴转化试验进行研究，试验结果表明，一次免疫组从免疫后的3d起，鸭外周血T淋巴细胞对ConA的反应增强，明显高于对照组，到第9d时达到峰值，然后迅速下降。二次免疫组于免疫后第9-12d时，鸭外周血T淋巴细胞对ConA的反应较强，且与一次免疫组差异极显著(P＜0.01)，第19d时，二次免疫组和一次免疫组差异显著(P＜0.05)。免疫后3-19d，一次免疫组和对照组差异极显著(P＜0.01)；免疫后26-33d，一次免疫组、二次免疫组和对照组，差异均不显著。 本研究表明，巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌二联蜂胶灭活疫苗安全、有效、无副作用，能够刺激机体迅速产生细胞免疫和体液免疫应答。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1禽多杀性巴氏杆菌研究概况

1.1.1病原学及流行病学

1.1.2禽霍乱疫苗研究

1.2禽葡萄球菌病研究概况

1.3 ELISA在禽病抗体检测中的应用

1.3目的意义

2材料

2.1试验菌株

2.2试验动物

2.3主要试剂

2.4试验仪器

2.5其它试验材料

3 方法

3.1菌种复壮

3.1.1巴氏杆菌复壮

3.1.2葡萄球菌的鉴定

3.2细菌毒力测定

3.2.1巴氏杆菌半数致死量测定

3.2.2葡萄球菌半数感染量测定

3.3疫苗制备

3.3.1菌液制备

3.3.2蜂胶制备

3.3.3疫苗制备

3.3.4疫苗无菌检验

3.3.5疫苗安全性检验

3.3.6疫苗最佳免疫剂量筛选

3.3.7疫苗保存期测定

3.4微量凝集试验

3.4.1微量凝集抗原制备

3.4.2微量凝集试验操作方法

3.5阳性和阴性血清制备

3.5.1阳性血清制备

3.5.2阴性血清制备

3.6间接ELISA抗原制备和ELISA参数选择

3.6.1间接ELISA抗原的制备

3.6.2间接ELISA方法的操作程序

3.6.3抗原最佳包被浓度选择

3.6.4 HRP-羊抗鸭IgG最佳作用浓度选择

3.6.5判断标准确定

3.6.6特异性试验

3.6.7重复性试验

3.6.8间接ELISA方法与微量凝集试验敏感性比较

3.7疫苗免疫监测

3.7.1实验鸭分组与免疫程序

3.7.2免疫鸭淋巴细胞转化试验

3.7.3疫苗免疫抗体检测

3.7.4攻毒保护试验

4结果

4.1毒力测定

4.1.1巴氏杆菌半数致死量

4.1.2葡萄球菌半数感染量

4.2疫苗制备

4.2.1疫苗性状、无菌检验及安全性检验结果

4.2.2最佳免疫剂量筛选

4.2.3疫苗保存期测定

4.3鸭外周血T淋巴细胞转化试验

4.4间接ELISA方法条件筛选

4.4.1抗原最佳包被浓度的选择

4.4.2最佳酶工作浓度选择

4.4.3判定标准

4.4.4特异性试验

4.4.5重复性试验

4.4.6敏感性试验

4.5 ELISA检测免疫鸭抗体水平

4.5.1巴氏杆菌抗体水平

4.5.2金黄色葡萄球菌抗体水平

4.6攻毒保护试验

5讨论

5.1关于疫苗研制

5.2疫苗对免疫鸭外周血T淋巴细胞转化效果的影响

5.3 ELISA条件筛选

5.3.1 ELISA判定标准

5.3.2包被抗原浓度

5.3.3酶标抗体浓度选择

5.4免疫鸭抗体水平动态变化

5.5关于Pmultocide-S．aureus二联蜂胶灭活疫苗的攻毒保护率

6结论

参考文献

致谢