水稻抗病基因同源序列分析及抗稻瘟病候选基因克隆

摘要

稻瘟病菌（有性态：Magnaporthe grisea，无性态：Pyricularia grisea）引起的稻瘟病是我国稻区和世界其它稻区最为严重的病害之一，该病害常年流行，致使稻米生产损失严重。稻瘟病的发生和流行同样要求流行病学三要素，即病原体、寄主、环境。选育和利用抗病品种不仅是有效切断流行病学三要素之一，为防止植物病害最经济、最有效的途径，而且还可以避免或减轻因使用农药而造成的残毒和环境污染问题。因此，抗病性一直为植物育种目标之一。抗病育种原理深入研究，对植物抗病育种具有理论指导和促进育种的作用。本研究通过分子生物学和生物信息学的方法，对四川省育种遗传材料和日本晴基因组进行了较为系统地研究：并结合育种实践提出了独特的抗病杂交育种方法。概括如下： 1．利用模糊搜索的方法，在TIGR水稻日本晴基因组数据库（TIGR Rice Genome Annotation-Release5）中识别出565个编码抗病蛋白质的同源序列；利用识别出565个编码抗病蛋白质序列分别与籼稻基因组数据库进行BLASTP联配，共确定320个对应的抗病基因同源序列。通过在线生物信息学软件，我们识别了这565个抗病基因的保守结构域、保守模体和DNA序列内转座子元件，其中有14个抗病基因同源序列注释错误。同时绘出了这些基因的基因组分布，并基于这些基因的同源树分析和基因组物理分布，认为基因的原位和远程复制事件产生了抗病基因的现存分布和多样性，其中转座子在复制过程中扮演了重要角色。 2．利用25个稻瘟病鉴别品种（系）和20个水稻品种（系）在人工接种条件下的对稻瘟病单孢菌株的抗性表型和抗病基因同源序列（Resistance gene analogs，RGAs）多态性进行聚类比较分析。以单孢菌株接种的抗性表型聚类，取相似系数0．450，可将45个品种（系）划分为A、B两大类；取相似系数0．618，A、B两大类又分别可分为i、ii、111、iv四个亚类。以抗病基因同源序列多态性聚类，取遗传相似系数0．620，可将45个品种（系）划归Ⅰ，Ⅱ两类，这两类明显地趋向籼粳两亚种划分；取遗传相似系数0．783时，类群Ⅰ又可划分为i、ii、iii、iv、v、vi六个亚类，类群Ⅱ又可划分为i、ii、iii、iv、v、vi、vii七个亚类。用抗感单孢稻瘟病菌表型聚类，倾向于抗谱相似的聚为一类；按RGA相似性聚类，倾向于遗传背景相近的聚为一类。对于抗病频率低或是抗病频率高的品种两者类与类之间有较好的对应关系，但总体看来类与类之间没有明显的对应关系。在抗稻瘟病育种方面，对亲本材料进行单孢菌株抗性鉴定和抗病基因同源序列多态性分析，可以更准确地反映亲本抗性遗传背景，从而避免同一抗源反复使用，还可以丰富培育品种的抗性遗传基础和延长品种抗性。 3．以高抗稻瘟病的水稻保持系福伊B为材料，利用已知在水稻籼、粳亚种间存在差异的RGA简并性引物N1N2克隆RGA序列片段。通过对抗病品系福伊B克隆扩增，获得一个通读的水稻抗病基因NBS类抗病基因同源片段FUyi_NBS1，长度为540bp，编码176个氨基酸。生物信息学分析表明，FUyi_NBS1在水稻基因组第二染色体上有3个拷贝，其中两个为抗病基因拷贝；经Blastp比较，含有一个NB-ARC保守结构域，与OsI_005459和CR273高度同源；与大麦NBS-LRR类抗病基因同源序列CAD45026同源率为58％。同源建模分析发现FUyi_NBS1包含至少7个α-螺旋区域和3个β-折叠。 4．利用GenBank数据库中的候选基因序列，设计分子引物，进行抗感品种之间的扩增差异，进行亚克隆抗病基因同源序列。在抗稻瘟病品系福伊B中获得了2条抗病基因同源序列，分别记为“FY_2”和“FY_3”，长度大小分别为2518bp和4168bp。经过生物信息学分析， FY_2的mRNA长度为1902bp，编码634个氨基酸；FY_3的mRNA长度为2226bp，编码742个氨基酸。通过蛋白质序列分析，两者均属于CC-NBS类型的抗病基因同源序列。与籼稻第2号染色体上的鸟枪片断OsI_005457高度同源。蛋白质三维结构分析，发现FY_2的NBS结构域与OsI_005457N端的NBS结构域在C端明显不同。本研究为福伊B中抗病基因克隆奠定了重要基础。 5．根据育种实践经验，提出了抗病杂交育种的策略和方法。概括起来为：抗抗杂交，胁迫选择，低代宽基数，抗中选优，连续鉴定，抗中选抗。

目录

文摘

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声明

第一章 文献综述

1 稻瘟病菌致病性与水稻抗病性研究进展

1.1 稻瘟病致病性研究进展

1.2 稻瘟病致病性或生理小种和遗传宗谱

1.3 无毒基因、致病性相关基因和基因组

2 水稻抗稻瘟病基因的研究进展

2.1 抗稻瘟病基因的遗传和鉴定

2.2 抗稻瘟病基因的定位和遗传图谱

2.3 抗稻瘟病基因的克隆及其结构功能

2.4 抗稻瘟病基因分子标记引物

3. 本研究意义

第二章 水稻全基因组编码抗病基因同源序列分析

1 材料和方法

1.1 数据库搜索和序列获得

1.2 蛋白质序列结构重新预测和DNA序列内转座子元件预测

1.3 序列同源树和系统发生树构建

2 结果与分析

2.1 水稻基因组中抗病基因同源序列数目

2.2 R基因蛋白质序列结构重新预测与归类

2.3 同源树的构建

2.4 R基因蛋白质保守结构域分析

2.5 抗病基因同源序列基因组DNA序列转座元件分析

2.6 转座元件在抗病基因同源序列中存在模式和抗病基因同源序列进化

3 讨论

3.1 抗病基因同源序列在水稻基因组中的丰度

3.2 水稻R基因蛋白质保守结构域

3.3 抗病基因同源序列的进化与转座元件

第三章 水稻品种稻瘟病抗性和抗病基因同源序列多态性分析

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 稻瘟病菌株的来源与培养

1.3 稻瘟病生理小种和水稻遗传材料抗病性鉴定

1.4 水稻基因组DNA提取与扩增

1.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 水稻品种抗稻瘟病表型

2.2 品种(系)RGA多态性

2.3 基于抗感单孢稻瘟病菌表型聚类分析

2.4 基于RGA相似性对品种(系)进行聚类

2.5 水稻抗稻瘟病性和抗病基因同源序列多态性比较

2 讨论

3.1 单孢菌株接种鉴定

3.2 抗稻瘟病表型与抗病基因同源序列多态性

4 结论

第四章 一个水稻NBS同源序列的分离和生物信息学分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 RGA-PCR扩增及克隆

2.2 序列分析和染色体定位

2.3 ORF预测和同源性聚类分析

2.4 同源建模和三维结构预测

3 讨论

4 小结

第五章 两个水稻抗病候选基因的克隆和生物信息学分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 RGA引物设计和PCR扩增

1.3 目的基因片断的克隆与鉴定

1.4 目的序列的生物信息学分析

2 结果与分析

2.1 目的基因片断的扩增与鉴定

2.2 目的基因片断测序和生物信息学分析

3 讨论

第六章 结论与对育种的几点认识

1 水稻抗稻瘟病基因的遗传与进化

1.1 抗稻瘟病基因的遗传与克隆

1.2 抗病基因的进化

1.3 抗病基因的克隆

2 水稻抗病育种几点识

2.1 杂交育种

2.2 其他方式育种

参考文献

致谢

在读期间撰写和发表的论文

附件