玉米C型细胞质雄性不育系及保持系microRNA克隆与功能分析

摘要

microRNA（简称miRNA）作为真核生物体内的一类负调控因子，在生物体内所起的调节作用几乎涉及到所有的细胞水平。从2002年首次发现植物miRNA以来，在短短六年时间里关于植物miRNA方面的研究报道层出不穷，但是迄今为止在各物种中所鉴定的miRNA数量还远远不及理论上的饱和值，而对miRNA相关功能研究更是该领域面临的一大挑战。作为非模式植物的玉米，在miRNA方面的研究自然落后于拟南芥和水稻，目前仅仅有96条玉米miRNA序列被登陆到miRNA数据库中。因此玉米miRNA的分离鉴定及功能分析在今后的很长一段时间内依然将是该领域的一个研究热点。本研究将玉米C型细胞质雄性不育系C48-2及其保持系N48-2作为研究对象，通过组织分离克隆的方法鉴定在花药中表达的miRNA，进一步对这些miRNA的靶基因进行了预测，并结合miRNA在不育系和保持系之间的表达差异和靶基因的相关功能分析，初步推断这些miRNA与玉米C型细胞质雄性不育特性之间的关系。现将本研究的结果小结如下： 1．克隆获得了81条大小在18～26bp的小分子RNA，主要富集在20～24bp范围内，去除tRNA、rRNA以及降解序列之后，通过mfold分析序列在基因组上是否形成符合miRNA前体标准的二级结构，结果得到10条符合标准的序列。 2．这10条序列的长度在21～24nt范围内，且其中5’端第一个核苷酸为“U”的有5条，这些特点和其它已鉴定的植物miRNA一致。进一步对它们进行物种间保守性分析发现，其中6条在水稻、小麦和拟南芥中存在不同程度的保守性，总体趋势表现为在单子叶水稻和小麦中的保守性高于双子叶植物拟南芥。 3．通过加尾-引物延伸RT-PCR法，对以上10条候选miRNA在C48-2和N48-2花药中的表达进行真实性验证，结果发现它们在两个材料的花药均有表达，证明了这10个miRNA是真实存在的，将其鉴定为新的玉米miRNA，归属于10个新的miRNA家族。 4．通过miRU植物miRNA靶基因预测软件和CSRDB、NCBI数据库以及Pfam氨基酸功能域分析软件，预测到其中9个miRNA作用的10靶序列。在这些靶序列中，有3个是包括MADS-box在内的转录因子，3个属于花药代谢过程中的关键酶，分别是NADH脱氢酶、细胞色素单P450单加氧酶和二氢黄酮醇-4-还原酶，1个为22KD的α-醇溶蛋白，2个分别是某种不确定的膜内在蛋白和具备抗氧化作用的特殊分子伴侣，另外一个功能不明。在这些靶基因中，NADH脱氢酶、细胞色素P450单加氧酶和二氢黄酮醇-4-还原酶已经被证明参与花药的能量代谢和物质代谢过程，并与植物雄性不育有着紧密联系；而MADS-box基因则是近年来被受关注的一类与植物育性相关的转录因子。 5．用实时荧光定量PCR法对这10个miRNA在C48-2和N48-2不同发育时期花药中的表达量进行检测，结果表明，在四分体期，10个miRNA在两个材料之间表达量均存在显著差异，表现为在C48-2中的表达量低于N48-2。此外，其中3个miRNA的表达量在两个材料的单核期也表现出明显差异，miR-1在C48-2中的表达量低于N48-2，而miR-6和miR-10与之相反。 6．结合miRNA在不育系、保持系间的表达量和其靶基因的相关功能分析，对miRNA调控与花药发育以及玉米细胞质雄性不育之间的关系有了初步的认识，总结如下： 第一，从四分体期到单核期，可育材料中10个miRNA的下调表达可能是花药正常发育的重要条件，也可能是花药正常发育后产生的结果，而miRNA在可育材料中有规律的时序性表达，证明了miRNA参与了花药发育的调控。 第二，miR-1、miR-2和miR-6在四分体时期与单核期可育系和保持系中的表达量均存在明显差异，暗示着这3个miRNA在四分体时期和单核期都参与了雄性败育过程。而miR-3、miR-4、miR-5、miR-7、miR-8、miR-9、miR-10对雄性不育的调控在单核期的表现得更明显一些。 第三，miRNA调控可能是引起不育的原因：miRNA在不育系中的异常表达导致了花药代谢过程中的关键酶以及相关转录因子的异常表达，进一步造成花药能量代谢和物质代谢的紊乱，从而使花粉得不到正常的发育； 第四，miRNA表达的异常可能是雄性不育产生的结果：受玉米细胞质雄性不育特性的影响，参与miRNA剪切过程的相关蛋白和调控miRNA基因表达的转录因子等表达量发生变化，从而在细胞内miRNA的含量相应变化，进而使受miRNA调控的基因表达发生异常。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 文献综述

1 关于microRNA

1.1 microRNA的概念、生物学特性

1.2 miRNA的发生

1.3 miRNA的作用机制

1.4 miRNA与siRNA

1.5 植物miRNA

1.6 植物miRNA的研究方法

2 植物花粉的发育与玉米细胞质雄性不育

2.1 植物花粉发育过程

2.2 关于玉米细胞质雄性不育

3 本研究的目的意义

第二部分 材料与方法

1 实验材料

1.1 玉米供试材料

1.2 克隆载体及宿主菌

1.3 主要试剂

1.4 试验主要仪器设备

2 实验方法

2.1 花药总RNA提取

2.2 花药小分子RNA分离

2.3 miRNA的克隆

2.4 阳性克隆的PCR检测及测序

2.5 序列的生物信息学分析

2.6 候选miRNA的验证及表达分析

2.7 miRNA候选靶基因表达差异分析

第三部分 结果与分析

1 花药总RNA与小分子RNA提取结果

2 小分子RNA两端连接接头、逆转录PCR扩增结果

3 回收产物后续操作

4 新发现的玉米miRNA

5 miRNA保守性鉴定

6 miRNA真实性验证

7 miRNA靶基因预测

8 miRNA在花药中的相对表达量

8.1 5S rRNA和miRNA加尾产物扩增溶解曲线

8.2 荧光定量的标准曲线

8.3 miRNA在花药中的相对表达量

9 MADS-box和Zein-alpha在N48-2和C48-2中的表达情况

9.1 MADS-box和Zein-alpha的RT-PCR检测

9.2 溶解曲线及标准曲线分析

9.3 MADS-box和Zein-alpha的定量分析

第四部分 讨论

1 对玉米花药miRNA鉴定的意义

2 miRNA的生物信息学鉴定与克隆鉴定

3 本研究所构建的小分子RNA文库

4 玉米花药中鉴定的miRNA

5 miRNA的靶基因

5.1 MADS-box与雄性不育

5.2 α-醇溶蛋白与花粉败育

5.3 NADH脱氢酶与花粉败育

5.4 细胞色素P450单加氧酶与花粉败育

5.5 二氢黄铜醇-4-还原酶与花粉败育

5.6 拟HSP33蛋白与花粉发育

5.7 其它转录因子与花粉败育

6 miRNA的调控与雄性败育时期

7 由miRNA调控的雄性败育机理探讨

8 展望

第五部分 结论

参考文献

致谢