枇杷种子退化的胚胎学机制及中度退化种子株系遗传多样性研究

摘要

本研究对多核枇杷品种种子退化及胚败育情况进行了调查，并首次从花药结构、花药散粉情况、花粉活力、柱头可受性、自然授粉后花粉原位萌发和花粉管生长特性、胚胎发育解剖观察等方面，系统研究了‘大五星’枇杷的雌雄性器官育性和胚胎发育过程，探明了多核枇杷品种种子退化及中度退化种子产生的胚胎学基础。采用扫描电镜技术和ISSR分子标记技术对‘大五星’、‘龙泉1号’、‘龙泉5号’3个栽培品种及其中度退化种子株系进行花粉亚显微形态和分子遗传多样性分析。同时，在形态学调查的基础上，从花药结构、花粉亚显微形态、花粉活力、柱头可受性、授粉亲和性、胚珠结构及胚胎发育过程等方面对少核株系C1和坐果极低且无核的115号株系进行了系统研究，明确了其少核和结果极少且无核的胚胎学机制。主要研究结果如下： 1.枇杷种子退化和胚败育调查 调查结果表明，‘大五星’、‘龙泉1号’和‘龙泉5号’3个枇杷品种平均每个果实中仅有2.47～3.29个胚珠最终能发育为大粒饱满种子，有0.08～0.16个胚珠发育为轻度退化种子，0.18～0.22个胚珠发育为中度退化种子，而多达6.45～7.19个胚珠发育为高度退化种子。3个品种的轻度退化种子、中度退化种子和高度退化种子平均单粒鲜重分别是正常饱满种子的13.42％～17.04％、4.16％～-6.36％和1.24％～2.24％。轻度退化种子胚败育率在33.78％～51.36％，中度退化种子的胚败育率为46.54％～70.59％，而高度退化种子的胚完全败育。 2.‘大五星’枇杷雌雄性器官的育性检测 雌雄性器官的育性检测表明：（1）‘大五星’品种花药较大而饱满，开花当日多数花药能纵裂散粉；花药结构正常，花粉量很多，畸形花少；开花2～4d花粉具较高活力，同时柱头具强可受性。表明‘大五星’枇杷在花期内雌雄性器官的育性强弱具有同步性，利于自然授粉结实。（2）自然授粉后，花粉粒在柱头上萌发主要集中在开花2～4d；开花5d约有90％花柱的柱头上有萌发的花粉粒；柱头具可受性的持续时间长约7d。同一花蕾中不同长度的花柱，柱头花粉原位萌发时间不一致，多数相差2～3d。（3）多数花粉管能生长到花柱上部，仅30％的花粉管能够生长至花柱基部；近85％的胚珠中发现有花粉管，但花粉管在胚珠中弯曲生长或沿珠被生长的现象严重，表明自然授粉条件下，‘大五星’枇杷表现出一定的受精前障碍。 3.‘大五星’枇杷的胚胎发育 解剖观察表明：（1）‘大五星’枇杷胚珠为倒生胚珠，蓼型胚囊和核型胚乳。（2）花蕾中多数胚珠能正常受精发育至球形胚和心形胚阶段，部分胚经鱼雷胚阶段发育为成熟子叶胚。胚乳细胞在大球胚阶段形成，在小鱼雷胚阶段解体。（3）开花14～23d，胚珠中可见合子、2-细胞原胚、T-形原胚、多细胞原胚、小球胚及扩散至珠孔端的胚乳核。开花29～48d，多数胚发育为大球胚和胚乳细胞，早受精的胚已发育为小心形胚阶段；而未受精胚珠的雌性生殖器解体成空胚囊。开花53～64d时，胚胎发育旺盛，胚珠中可见大球胚、鱼雷胚、小子叶胚及成熟种胚。（4）开花90～120d，果实进入膨大初期（纵径为1.667cm～2.209cm、横径为1.432cm～1.904cm），果实中3～4枚成熟子叶胚继续发育为饱满大粒种胚；约3枚胚珠因未受精发生珠心、胚囊解体，最终形成完全退化种子；另约3枚受精胚珠发育至球胚、心形胚及鱼雷胚阶段，但胚囊内胚乳细胞和珠心组织提前解体导致其无法继续发育，至果实成熟时形成高度败育的种子；此期发育至小子叶胚阶段的胚，部分能继续发育为成熟种胚，但因养分及激素竞争处于弱势，子叶长度和厚度均明显小于正常的种胚，形成中度退化种子。开花64～90d，是影响受精胚胎能否继续发育的关键时期。 4.中度退化种子株系的花粉亚显微形态多样性 花粉亚显微形态分析表明：（1）正常的枇杷花粉为长球形（P/E为1.42～1.73），赤道面观为长椭圆形，极面观为三裂圆形；花粉为中等大小（28.21um×19.22um～33.98um×20.16um）；萌发孔为典型的三孔沟结构。（2）26份中度退化种子株系中出现发育不良小花粉和变形大花粉的比率较大，其中6个株系花粉畸形率高达41.82％～83.65％。（3）29份枇杷材料的花粉外壁纹饰丰富多样，甚至绝大多数材料的同一花粉3个赤道面上的条纹走向都不一致。‘大五星’、‘龙泉1号’和‘龙泉5号’3个亲本品种花粉外壁雕纹属于条纹状、条纹-穴状（或条纹-穿孔状）和条纹-颗粒-穴状（或条纹-颗粒-穿孔状）。26份中度退化种子株系的花粉除具亲本的纹饰外，还出现脑纹-穿孔状雕纹类型：同时中度退化种子株系既具亲本特征的花粉类型，又分离出其亲本间的过渡类型和原始类型，花粉形态有平行、交叉现象，这与形态学特征表现出的多样性一致。 5.中度退化种子株系的分子遗传多样性 ISSR标记技术对‘大五星’、‘龙泉1号’与‘龙泉5号’3个亲本及59份中度退化种子株系的多样性分析结果表明，18条ISSR引物在62份供试材料中共扩增出324条带，其中310条多态性带，多态性比率为95.7％，18条引物在62份枇杷材料的平均有效等位基因数、平均Nei's基因多样性指数和平均Shannon信息指数分别为1.5654、0.3249和0，5283。ISSR分析结果进一步表明，枇杷中度退化种子株系具有丰富的遗传物质基础以及高度复杂的遗传背景。 6.C1株系坐果率较低、多独核的胚胎学机制 雌雄育性检测及胚胎发育观察表明：（1）C1株系药隔组织较其亲本‘龙泉5号’发达，药室腔较小，花粉粒数量较少，并有58.94％为发育不良的小花粉，使其花粉活力及花粉萌发率均较低（分别为16.83％和14.58％），表现出浅度雄性不育。（2）Cl株系花柱数目不为5枚的花蕾比率高达35.92％，同时，花蕾中花柱长短不均，短花柱比例较高。较高比例的异常花柱数和短花柱使其接受花粉、花粉萌发和花粉管生长均受到抑制，导致能受精的胚珠较少。（3）C1株系绝大多数胚珠结构正常，部分胚珠能正常受精并进一步发育为球形、心形、鱼雷形及子叶胚。但同一果实的胚珠间受精和胚发育不同步，导致养分及激素分配偏向早受精的胚，晚受精的胚多停留在球胚阶段，最终导致果实坐果率较低，果实中能发育成熟的种胚仅1～2粒。 7.115号株系结果极少、无核的胚胎学机制 雌雄育性检测及胚珠结构解剖观察表明：（1）115号株系叶大、花大、花期长，但自花授粉坐果率极低，不到0.01％；果实较小、无核。（2）115号株系开花时花药发育不成熟，多数花药仍为具4个小孢子囊的不成熟结构，少数的成熟花药药壁不能及时开裂散粉。同时，药隔组织极厚，药室腔极小，花粉数量极少，并且83.65％为变形花粉粒。花粉活力和花粉萌发率极低（分别仅为3.67％和0.89％）。115号株系雄性器官表现为深度不育。（3）115号株系花柱数目>6枚的花蕾比率高达31.25％；花粉原位萌发及花粉管生长异常比例高，表现出较强的受精前障碍。（4）115号株系绝大多数胚珠结构异常，包括小胚囊、雌性生殖器退化、胚囊退化和胚珠退化等4类，115号株系雌性器官为重度败育类型。（5）异常的胚珠结构不能提供受精及胚胎发育的场所，最终导致115号株系自然授粉和自花授粉基本不结果，异花授粉坐果率仍很低。即使极少数结构正常的胚珠能受精，但因有性生殖器官先天发育不足，缺少受精和胚胎发育的物质基础，因而胚胎发育受阻，同时，果肉细胞因缺少来自种子的激素刺激而发育缓慢。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

引言

1 果树胚败育的胚胎学机制研究进展

1.1 雄性不育

1.2 雌性不孕

1.3 授粉受精不良

1.4 胚中途败育

2 果树退化种子植株的遗传多样性及其育种潜质

3 分子标记在枇杷种和品种遗传多样性研究中的应用

4 花粉亚显微形态在植物分类与杂种鉴定上的应用

5 研究的目的与意义

第二章 枇杷种子退化的胚胎学机制研究

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 多核枇杷品种种子退化及胚败育情况

2.2 花药结构、花药散粉、花粉活力及花粉密度

2.3 柱头可受性与黏液分泌

2.4 自然授粉花粉原位萌发与花粉管生长特性

2.5 胚胎发育过程

3 讨论

3.1 ‘大五星’枇杷有性生殖特性

3.2 多核枇杷品种种子退化和胚败育的胚胎学机制

图版

第三章 中度退化种子株系的遗传多样性研究

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 花粉亚显微形态观察

2.2 中度退化种子株系的ISSR遗传多样性分析

3 讨论

3.1 用于枇杷花粉亚显微形态观察的制样方法

3.2 枇杷中度退化种子株系花粉形态的多样性

3.3 ISSR的可靠性

3.4 中度退化种子株系的遗传多样性及其利用前景

图版

第四章 C1株系和115号株系雄性可育性鉴定

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 C1 株系和115 号株系的植物学性状比较

2.2 花药形态及散粉情况比较

2.3 花粉活力与花粉密度比较

2.4 花粉萌发率比较

2.5 花药显微结构比较

3 讨论

3.1 中度退化种子株系花柱数目多样性及其在枇杷分类中的探讨

3.2 C1 株系和115 号株系雄性育性的确定

3.3 115 号株系雄性不育原因的进一步研究

图版

第五章 C1 和115 号株系雌性育性鉴定

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 受精花与未受精花中花柱类型比较

2.2 不同发育阶段花柱柱头可受性比较

2.3 C1 株系不同相对长度花柱柱头可受性比较

2.4 C1 株系花粉原位萌发和花粉管生长

2.5 115号株系花粉原位萌发与花粉管生长

2.6 C1 株系和115 号株系胚珠结构和胚胎发育观察

3 讨论

3.1 花柱长度与柱头可受性、花粉萌发和花粉管生长之间的关系

3.2 C1 株系不同长度花柱的自交不亲和性差异

3.3 C1 株系及115 号株系雌性育性确定

3.4 C1 株系少核、115 号株系结果极少和果小焦核的胚胎学机制

图版

结论与创新点

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文和取得的科研成果