伪狂犬活疫苗(Bartha-K61株)生产工艺的关键技术改进研究

摘要

伪狂犬病(Pseudorabies)又称Auj eszky氏病，是一种由伪狂犬病毒引起的多种家畜和野生动物的急性传染病。本病广泛分布于世界各地，在我国该病也广泛存在，尤其猪的伪狂犬病，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。因此伪狂犬病的预防不仅有利于我国养猪业规模化发展，而且对于相关疫病防控、疫苗研发与生产具有很好的指导意义。
　　 本研究主要针对伪狂犬活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺改进中的关键技术进行改进，在遵循《伪狂犬病活疫苗生产与检验规程》的前提下，用伪狂犬病毒Bartha-K61株制备病毒液，通过对一系列影响病毒效价的关键技术进行工艺优化，最终科学制定生产流程，确立最优的病毒增殖培养条件、最佳的收获时间、最适的保存条件及时间，达到提高病毒液的效价、增加病毒液的收率及利用率、降低生产成本、提高经济效益的目的。
　　 不同接种方式对病毒效价的影响：用同步接种与传统接毒方式（单层细胞接种）分别接毒，结果表明伪狂犬病毒（Bartha-K61株）采取同步接种与单层细胞接种收获的病毒效价没有显著差异，在安全检验、效力检验，结果表明试验批疫苗完全可达到该疫苗的标准要求，有很好的安全性、对动物有较高的保护力。另外，采取同步接种方式更节约原辅材料的使用，可降低生产成本，缩短生产周期。
　　 不同梯度的接种量对病毒效价的影响：用12％、10％、8％三种接种量梯度接种细胞，结果表明三种梯度接种量增殖病毒的方法收获的病毒效价没有显著差异；8％接种量试验组制备疫苗进行安全检验、效力检验均完全符合疫苗的标准要求，有很好的安全性、对动物有较高的保护力。不仅如此，降低种毒的使用量在生产中大大降低生产成本。因此，选择8％的接种量作为生产工艺标准较优。
　　 不同体积培养液对病毒效价的影响：用同步接种方式接种伪狂犬病毒Bartha-K61株，各试验组加入培养液体积分别为1200ml/瓶、1500ml/瓶、2000ml/瓶，结果表明不同培养液体积的改变对病毒液效价的影响没有显著差异，相关成品的安全检验、效力检验可达到该疫苗的标准要求。但是从稳定生产、质量均衡的角度看，每瓶加入1500ml最符合生产需求，因此选择1500ml培养体积最终培养体积。
　　 不同培养收获时间对病毒效价的影响：单层鸡胚成纤维细胞接毒后，分别选取培养48h、60h、72h进行冻融、收获，结果表明病毒增殖培养时间为72h的病毒效价显著低于培养时间为48h和60小时。但是从生产实践来看，便于规模化大生产，选择病毒培养时间为48h进行冻融收获便于操作，也可缩短生产周期。
　　 不同保存条件及时间对病毒效价的影响：采取病毒效价符合规定的病毒液(1055TCID50/ml)，在2-8℃和-15℃两种条件下分别保存10天、20天、30天后，再次测定其病毒效价。结果表明，保存时间在20天内，在2～8℃保存的病毒效价损失不明显，而在-15℃保存的病毒液效价损失比较明显。因此，在大生产过程中为降低或减少在保存过程中的病毒效价的损失，同时考虑保存条件等设备因素，我们选择病毒液在2～8℃条件下保存，不超过20天。

目录

文摘

英文文摘

1 概述

1.1 病原学

1.2 PRV分子生物学特性

1.3 PRV抗原研究

1.4 病原性

1.4.1 猪

1.4.2 牛

1.4.3 绵羊

1.5 PRV疫苗研究进展

1.5.1 灭活疫苗

1.5.2 弱毒疫苗

1.5.3 基因缺失疫苗

2 目的与意义

3 材料与方法

3.1 试验材料

3.1.1 种毒

3.1.2 细胞来源

3.1.3 主要试剂及溶液

3.1.4 实验动物

3.1.5 主要实验器材

3.2 试验方法

3.2.1 细胞悬液制备

3.2.2 接毒工艺改进

3.2.3 不同培养收获时间对病毒效价的影响试验

3.2.4 不同保存条件及时间对病毒效价的影响试验

4 试验结果

4.1 接毒工艺改进试验结果

4.1.1 不同接种方式对病毒效价的影响试验

4.1.2 不同梯度的接种量对病毒效价的影响试验

4.1.3 不同体积培养液对病毒效价的影响试验

4.2 不同培养收获时间对病毒效价的影响试验结果

4.3 不同保存条件及时间对病毒效价的影响试验结果

5 讨论

5.1 关于细胞制备的讨论

5.2 同步接种的可行性和必要性

5.3 病毒接种量、培养体积对病毒产量的影响

5.4 关于病毒收获时间的讨论

5.5 病毒液保存条件的摸索

5.6 试验改进对动物安全性的影响

5.7 有关生产成本的讨论

5.8 现有传统疫苗生产工艺改进的比较与展望

6 结论

参考文献

致谢