副猪嗜血杆菌基因组表达文库的构建与其荚膜多糖输出蛋白基因的筛选和免疫原性研究

摘要

副猪嗜血杆菌病已成为严重危害全球养猪业的一种重要细菌病。目前对该病原的研究特别是其致病与免疫机理的研究尚处于起步阶段。进行副猪嗜血杆菌致病与免疫机理的研究，对于该病的预防、诊断和控制具有重要意义。本研究以副猪嗜血杆菌SC-1四川分离株为材料，构建其基因组表达文库，并对该菌的体内诱导抗原基因进行筛选，并进一步对已筛选的副猪嗜血杆菌荚膜多糖输出蛋白基因进行免疫原性的研究。研究内容如下：
　　 1.副猪嗜血杆菌SC-1株基因组表达文库的构建研究本研究以血清4型副猪嗜血杆菌SC-1四川分离株为材料，按照常规分子克隆手段构建其基因组表达文库。采用SDS-蛋白酶K法提取副猪嗜血杆菌SC-1株基因组DNA，获得了高质量的基因组DNA。用Sau3AⅠ酶对基因组进行酶切，优化酶量及其作用时间，结果表明用0.25μL的酶于37℃，酶切2.5μg基因组DNA1h，产生的500bp～2000bp片段效果最佳。按此条件大量酶切基因组DNA并回收纯化500bp～2000bp左右的片段。同时，用BamHI分别酶切原核表达载体pRSETA、pRSETB、pRSETC，并对载体进行去磷酸化。将基因组片段与去磷酸化处理的表达载体pRSETA/B/C连接转化到大肠杆菌DH5a中，随机挑取转化菌落进行菌落PCR鉴定。PCR结果表明外源插入片段大小范围在500bp～2000bp之间，插入率达到80％以上；大量提取转入DH5a中的质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得转化子达1.2×105CFU，即副猪嗜血杆菌基因组表达文库的库容量为1.2×105CFU。随机挑取转化菌落进行核苷酸序列测定，测序结果表明：外源插入片段均为副猪嗜血杆菌基因组片段，与副猪嗜血杆菌(SH1065,CP001321.1)序列同源性高达99％以上。上述结果表明成功构建了血清4型副猪嗜血杆菌基因组表达文库，为筛选副猪嗜血杆菌体内诱导抗原基因奠定了基础。
　　 2.副猪嗜血杆菌SC-1株体内诱导抗原基因的初步筛选及鉴定研究在构建的副猪嗜血杆菌SC-1株基因组表达文库的基础上，用人工感染副猪嗜血杆菌制备的阳性血清对其基因组表达文库进行体内诱导抗原基因的免疫筛选及鉴定。用体外培养的副猪嗜血杆菌SC-1株和BL21宿主菌及其超声裂解液、热变性裂解液依次吸附人工感染的阳性血清，以除去体外培养表达抗原产生的非特异性抗体亚群。处理过的血清经ELISA鉴定表明，随着吸附的进行，血清的D450nm值逐渐下降，直至稳定。Westernblot鉴定表明，经过多次吸附后的血清中不再含有针对体外培养表达抗原诱导产生的抗体。以此血清对表达文库进行了三次免疫筛选，最终获得5个阳性菌落。5个阳性菌落经过核苷酸序列测定，表明外源插入片段与GenBank公布的副猪嗜血杆菌基因组序列同源性达99％以上。针对测序结果设计了5对特异性扩增外源插入片段的引物，抽提体外培养的副猪嗜血杆菌的mRNA，进行RT-PCR，结果表明上述基因在体外不发生转录，副猪嗜血杆菌SC-1株体内诱导抗原基因筛选成功。用OFRFinder分析外源插入片段，发现5个可能具有生物学意义的ORF;该ORF序列用BLAST与副猪嗜血杆菌基因组序列比对，分别涉及酪氨酸磷酸酯酶基因(IVI-1)、异亮氨酰-tRNA合成酶基因(IVI-2)、荚膜多糖输出蛋白基因(IVI-3)及2个假定蛋白基因（IVI-4、IVI-5）；通过DNAstar软件分析5个开放阅读框的抗原性，表明其编码产物均存在多个抗原位点。其中荚膜多糖输出蛋白基因的成功筛选和鉴定，为进一步研究其免疫原性研究打下了基础。
　　 3.副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白的克隆表达及免疫原性初步研究以荚膜多糖输出蛋白基因为研究对象，对其进行免疫原性研究。根据提交NCBI的荚膜多糖输出蛋白基因(IVI-3,CPEP)序列（GenBank登录号为HM063414）设计一对引物，对其全基因进行扩增，构建原核表达载体pET32a-CPEP。表达质粒pET32a-CPEP经过菌落PCR及双酶切鉴定正确后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株。用IPTG诱导宿主菌获得表达，SDS-PAGE分析表明重组荚膜多糖输出蛋白分子量约为35kD。同时对IPTG工作浓度和诱导时间进行了优化，确定获得最高表达量的条件为：IPTG最佳工作浓度为终浓度1.0mM，最佳诱导时间为5h。用猪抗副猪嗜血杆菌阳性血清对表达的蛋白进行Westernblot检测，在35kD处出现明显的反应条带，表明重组荚膜多糖输出蛋白具有良好的反应原性。
　　 将纯化的重组荚膜多糖输出蛋白蛋白（A组）、副猪嗜血杆菌SC-1全菌灭活抗原(B组)，分别与弗氏佐剂进行乳化，分两次间隔两周皮下多点接种小鼠，同时，设立PBS加佐剂（C组）、PBS（D组）作为对照。在首免前(0d)以及首免后的14d、28d采集小鼠血清，用ELISA检测特异性抗副猪嗜血杆菌的抗体水平。在首免后14d,A组、B组检测到特异性抗副猪嗜血杆菌抗体的产生。首免后28d,A组与B组检测到特异性抗体的产生较两周前抗体水平进一步提高，其中B组抗体水平高于A组。C组与D组整个免疫过程未检测到特异性抗副猪嗜血杆菌抗体。上述结果表明重组荚膜多糖输出蛋白有一定免疫原性。
　　 二免后两周以副猪嗜血杆菌SC-1株1000倍半数致死量进行攻毒。A组小鼠在攻毒后三天开始出现死亡；C组和D组小鼠在攻毒后两天，开始出现死亡，5天内两组的小鼠全部死亡。观察一周后，A组死亡6只，保护率为40％;B组小鼠没有死亡，保护率为100％;C组及D组全部死亡。结果表明重组荚膜多糖输出蛋白对小鼠有一定的的保护率。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一章 文献综述

1 副猪嗜血杆菌研究进展

1.1 副猪嗜血杆菌生物学特性

1.2 副猪嗜血杆菌致病因子

1.3 副猪嗜血杆菌基因研究现状

2 基因组文库构建技术及其筛选策略

2.1 基因组文库构建的基本原理及主要步骤

2.2 基因组文库的主要筛选策略

3 细菌毒力基因体内表达检测系统研究进展

3.1 细菌毒力基因体内表达检测方法研究进展

3.2 体内诱导抗原鉴定技术基本原理及步骤

3.3 体内诱导抗原鉴定技术的优点与缺点

3.4 体内诱导抗原鉴定技术的应用与展望

第二章 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组表达文库的构建及鉴定研究

1 引言

2 材料

2.1 菌株及质粒

2.2 主要试剂

2.3 培养基及试剂配制

2.4 主要仪器设备

3 方法

3.1 副猪嗜血杆菌SC-1株的活化

3.2 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组DNA提取

3.3 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组酶切

3.4 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组DNA片段的回收

3.5 构建文库使用载体的制备

3.6 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组文库构建

3.7 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组文库的PCR鉴定

3.8 重组质粒测序及序列分析

4 结果与分析

4.1 副猪嗜血杆菌SC-1株的活化

4.2 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组DNA提取

4.3 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组酶切

4.4 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组DNA片段的回收

4.5 构建文库使用载体的制备

4.6 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组文库构建

4.7 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组文库的PCR鉴定及插入率估算

4.8 重组质粒测序及序列分析

5 讨论

5.1 基因组DNA的质量

5.2 限制性内切酶的选择

5.3 表达载体的选择

5.4 基因组文库的质量

6 小结

第三章 副猪嗜血杆菌SC-1株体内诱导抗原基因的初步筛选及鉴定研究

1 引言

2 材料

2.1 菌株、血清及试验动物

2.2 主要试剂

2.3 试剂配制

2.4 主要仪器设备

3 方法

3.1 人工感染康复血清的制备

3.2 副猪嗜血杆菌SC-1株人工感染混合猪血清的吸附

3.3 血清最佳稀释倍数的确定

3.4 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组文库的筛选

3.5 假定阳性抗原克隆的重复筛选

3.6 假定阳性抗原克隆的第三次筛选

3.7 阳性克隆的PCR鉴定

3.8 体内诱导抗原基因的测序及生物信息学分析

3.9 体内诱导抗原基因的RT-PCR鉴定

4 结果与分析

4.1 人工感染康复血清的制备

4.2 副猪嗜血杆菌SC-1株人工感染混合猪血清的吸附

4.3 血清最佳稀释倍数的确定

4.4 副猪嗜血杆菌SC-1株基因组文库的筛选

4.5 阳性克隆的PCR鉴定

4.6 体内诱导抗原基因的测序及生物信息学分析

4.7 体内诱导抗原基因的RT-PCR鉴定

5 讨论

5.1 血清探针的制备和鉴定

5.2 体内诱导抗原基因的筛选

5.3 体内诱导抗原基因的生物信息学分析

6 小结

第四章 副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白的克隆表达及其免疫原性初步研究

1 引言

2 材料

2.1 菌株、血清及试验动物

2.2 主要试剂

2.3 试剂配制

2.4 主要仪器设备

3 方法

3.1 副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白(CAPSULAR POLYSACCHARIDE EXPORT PROTEIN, CPEP)基因的扩增

3.2 副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白基因的克隆及鉴定

3.3 重组质粒的序列测定及序列分析

3.4 原核表达载体PET32A-CPEP的构建与鉴定

3.5 重组质粒转化E. COLI BL21(DE3)

3.6 重组荚膜多糖输出蛋白的表达与鉴定

3.7 重组荚膜多糖输出蛋白的纯化

3.8 重组荚膜多糖输出蛋白免疫保护性研究

4 结果及分析

4.1 副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白基因的扩增

4.2 副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白基因的T-A克隆及鉴定

4.3 重组质粒的序列测定及序列分析

4.4 原核表达载体PET32A-CPEP的构建与鉴定

4.5 重组荚膜多糖输出蛋白的表达与鉴定

4.6 重组荚膜多糖输出蛋白的纯化

4.7 重组荚膜多糖输出蛋白免疫保护性研究

5 讨论

5.1 表达基因的选择

5.2 表达系统的选择

5.3 表达产物的免疫反应原性

5.4 重组蛋白的表达纯化

5.5 重组蛋白免疫原性

6 小结

本论文创新性工作

结论

参考文献

致谢

附录

攻读学位期间发表的学术论文目录