小麦EST-SSR标记对小麦及其近缘种属的遗传多样性研究

摘要

小麦作为重要的粮食作物已经有8000年以上的栽培历史了，在我国为第二大粮食作物。做好小麦育种有助于解决我国粮食问题，有利于我国的安定与发展。因而小麦的育种工作在我国有着举足轻重的地位。然而长年的有计划的小麦育种使小麦的遗传基础越来越狭窄，特别是在抗病育种上。原有抗性基因的失效，加剧了小麦进行遗传改良的迫切性。而小麦的近缘种属正是扩大小麦遗传资源的绝好材料。
　　 本研究正是以为小麦育种寻找广泛的遗传材料为出发点，探讨小麦EST-SSR标记在小麦近缘种属黑麦、偃麦草、山羊草、赖草、簇毛麦上的通用性以及遗传多样性，进而为小麦育种扩展遗传材料做好理论铺垫。实验利用95对小麦EST-SSR标记对来源于六属的60份材料进行了遗传多样性研究并进一步通过基因组原位杂交(GISH)对普通小麦中国春与黑麦、簇毛麦进行了亲缘关系鉴定。其结果如下：
　　 (1)实验中所选用的95对小麦EST-SSR标记中有71对能够在小麦、黑麦、偃麦草、山羊草、赖草以及簇毛麦中进行稳定有效地扩增，从而印证了EST-SSR标记的良好通用性。
　　 (2)本次实验中71对EST-SSR引物共检测出221个等位基因，平均每个位点检测出3.1127个等位基因，平均有效等位基因数为2.0753个。位点多态信息含量(PIC)为0.1102～0.8081，平均多态信息含量为0.5181；遗传多样性指数(Ⅰ)在1.8541～0.2541之间，平均遗传多样性指数为0.7627。对60份供试材料进行聚类分析，可以观测到遗传差异与其种属间的关系较为明显，同一种属的材料分别聚为一类，这与传统的分类学是相符合的；在同一属内能够基本上将不同分类的材料（以种分类或地理来源分类）聚为一类。这说明所选用的小麦EST-SSR标记具有较高的多态性并且能够有效地进行品种鉴定以及地理亲缘关系鉴定。
　　 (3)不同种属间多态位点百分比在15.49～69.01％之间变化。各种属间的多态位点百分比从大到小依次为小麦、黑麦、偃麦草、山羊草、簇毛麦、赖草；不同种属间，各种属平均遗传多样性指数范围为0.1355～0.5160。各种属间按遗传多样性指数从大到小排列为小麦、黑麦、偃麦草、山羊草、簇毛麦、赖草。多态位点百分比与平均遗传多样性指数在各属间的表现是相同的。
　　 (4)对不同种属间的遗传相似系数(GS)进行比较并构建的亲缘关系树状图发现，五属与小麦的亲缘关系从近到远依次是黑麦、山羊草、偃麦草、赖草、簇毛麦。这与传统的小麦及其近缘种属间的亲缘关系有异。以小麦、黑麦，簇毛麦为例，小麦与簇毛麦的亲缘关系相较于黑麦而言应该更近，而实验的结果却与之相反。
　　 (5)测序结果表明小麦与其近缘种属黑麦、偃麦草、山羊草、簇毛麦的序列差异基本上体现在部分碱基的改变以及个别碱基的增减上面。而这些序列的差异在不同位点上表现出不同的序列相似度即不同的亲缘关系。有些与前面种属间的聚类分析相异，有些又能够部分印证。针对总体情况而言，在位点MAG278、MAG479、MAG1571、MAG1757上，虽然各属间的亲缘关系与所有供试材料的各属间的聚类结果不尽相同，但是却在一定程度上印证了小麦与黑麦的亲缘关系近于小麦与簇毛麦的亲缘关系的聚类结果。
　　 (6)利用普通小麦中国春基因组DNA对黑麦以及簇毛麦进行基因组原位杂交检测，结果表明小麦与簇毛麦的亲缘关系更近，与黑麦的亲缘关系远于簇毛麦。这与EST-SSR标记的聚类结果相异，这表明重复序列与EST序列在小麦族的进化中可能是有所差异的，但这种差异尚需进一步地研究。
　　 通过对分属六属的小麦族中60份材料的遗传多样性的分析表明小麦EST-SSR标记不仅可以在各属间进行有效地扩增，体现出各属间以及各属内的遗传差异和变异，进行品种鉴定以及地理亲缘鉴定；同时EST序列直接体现基因功能的不同表达，序列同源性的比较可能也正体现了不同材料间基因的表达与否以及基因的表达差异。因此本次实验为在小麦的近缘种属材料中寻找广泛的可供选择使用的遗传材料以及直接利用有利基因到小麦育种工作中去提供了一定的理论支持。

目录

文摘

英文文摘

1 文献综述

1.1 小麦近缘种属遗传多样性研究

1.1.1 遗传多样性的含义及意义

1.1.2 遗传多样性的研究方法

1.1.3 小麦近缘物种

1.2 微卫星DNA的概述

1.2.1 SSR的发展及其应用原理

1.2.2 SSR技术的实践方法

1.2.3 小麦SSR在小麦近缘种属物种中的应用

1.3 表达序列标签(EST)概述

1.3.1 EST的概念和产生

1.3.2 EST计划和EST标记

1.3.3 EST-SSR

1.4 实验的目的意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 基因组DNA提取

2.2.2 引物的稀释

2.2.3 PCR扩增与电泳分析

2.2.4 部分扩增片段回收测序

2.2.5 基因组原位杂交(Genomicin Situ Hybridization GISH)

2.2.6 数据处理

3 结果与分析

3.1 基于标记位点的遗传多样性分析

3.2 测序结果分析

3.3 黑麦、簇毛麦分别与普通小麦CS的原位杂交分析

4 讨论

4.1 EST-SSR标记的遗传多样性分析

4.2 原位杂交揭示的亲缘关系

4.3 部分EST-SSR标记回收序列的分析

附录

参考文献

致谢