核转录因子-kBC-Rel亚基克隆及C-Rel/P65/P50对猪伪狂犬病毒在BHK21细胞上增殖的影响

摘要

细胞核因子-1κB(Nuclear factorκappa B)是一种较特殊的转录调节因子，普遍存在于真核细胞内，对宿主先天性免疫反应及细胞增殖、分化和凋亡起到关键的调节作用。细胞核转录因子-κB可以通过调控相关靶基因的转录与表达，参与机体的多种生理活动，当机体感染细菌或病毒等致病因素，其信号通路将在一系列酶的作用下被激活，参与宿主的免疫应答，它的异常活化可能是PRV导致免疫抑制的重要原因。为获得猪NF-κB C-Rel亚基序列特性，对PRV感染导致的免疫抑制与NF-κB表达异常的关联性进行研究，本试验通过NCBI GeneBank中猪核转录因子-κB C-Rel亚基序列（XM_003125115）设计特异性引物，对NF-κBC-Rel全序列进行克隆、序列鉴定及生物信息学分析;对PRV感染PK-15细胞对C-Rel转录时相的影响进行分析;并构建NF-κB C-Rel真核表达载体，对NF-κBC-Rel亚基真核表达产物对PRV复制的影响进行探讨，结果如下:
　　1.猪核转录因子NF-κB C-Rel亚基的克隆及序列鉴定本实验采用RT-PCR方法从猪外周血淋巴细胞中扩增到NF-κB C-Rel ORF区并克隆至pMD19-T simple vector，克隆获得阳性质粒后测序，进行相关生物信息学分析。序列分析结果表明:所扩增猪C-Rel亚基ORF长1773 bp，编码590 aa;猪C-Rel核苷酸序列与不同动物的C-Rel核苷酸序列相似性较高;大部分位于细胞核(76.0％)内，无信号肽及跨膜区。
　　2.PRV感染PK-15细胞对NF-κB C-Rel亚基mRNA转录时相的影响分析本实验成功构建了NF-κB C-Rel亚基基因的荧定量检测方法;运用此方法对PK-15细胞感染PRV后，不同时段的细胞中C-Rel亚基mRNA转录情况进行测定并分析。结果表明:标准品拷贝数在一定的浓度范围内有极好的线性关系，相关系数达到0.998，扩增效率为103.8％;特异性强，扩增产物形成单一的特异性融解峰;灵敏性高，能检出102copies/ul的标准质粒;重复性好，组内变异系数较小。PK-15感染PRV后，与对照组相比:0～4h，C-Rel转录水平下调，在2 h和4h差异显著(P＜0.05);4～12h，C-Rel转录水平快速上调，12h达到转录高峰(P＜0.01);12 h后C-Rel转录水平逐渐下降，24～120 h，均维持在较低水平，其中36h差异极显著(P＜0.01)，48 h，72 h和120 h差异显著(P＜0.05)。可见，PRV的感染会导致PK-15细胞中NF-κB活化水平的降低，这与目前的相关研究结果基本相符。
　　3.猪NF-κappaB C-Rel亚基真核表达载体的构建及C-Rel/P50/P65转染BHK21细胞对PRV增殖的影响本实验为了研究不同NF-κB(C-Rel/P65/P50)对PRV增殖的影响，成功构建了pCDNA3.1(+)-C-Rel真核表达载体，与本实验室已构建的P50，P65真核表达载体两两组合，应用脂质体法转染BHK21细胞，C-Rel、P50、P65亚基的表达水平通过Westem-blot法被成功检测;将pCDNA3.1(+)空载体、pCDNA3.1(+)-C-Rel、pCDNA3.1(+)-C-Rel+pCDNA3.1(+)-P65、pCDNA3.1(+)-C-Rel+pCDNA3.1(+)-P50-RHD分别转染至BHK21细胞，转染14h后接种PRV，应用本实验构建的PRV gE基因荧光定量PCR方法，对细胞上清中病毒粒子增殖时相进行检测，绘制PRV一步生长曲线。本实验成功构建了猪pCDNA3.1(+)-C-Rel真核表达载体，且能够在BHK21细胞中表达;转染C-Rel/C-Rel、C-Rel/P50-RHD、C-Re/P65真核表达质粒均能促进细胞病变的提前出现;由各转染组PRV一步生长曲线结果可知，C-Rel/C-Rel、C-Rel/P65能有效减缓PRV在BHK21细胞上增殖的进程，其中，C-Rel/P65的抑制作用更强。可见，NF-κB C-Rel/C-Rel、C-Rel/P65二聚体能在一定程度上抑制PRV在BHK21细胞中的增殖。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 文章综述、研究目的及意义

1 核转录因子-κB概述

1．1 核转录因子-κB成员及功能

1．2 核转录因子-κB信号通路的激活途径

1．3 核转录因子-κB的调节作用

1．4 核转录因子κB的生物学功能

2 PRV概述

2．1 病原

2．2 培养特性

2．3 流行病学

2．4 临床症状

2．5 NF-κB在PRV的感染机制中的作用研究

3 研究目的及意义

第二部分 试验研究

第一章 猪NF-κB C-Rel基因的克隆及序列分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章 PRV体外感染PK-15细胞对C-Rel转录时相的影响

1 试验材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 猪NF-κB C-Rel亚基真核表达载体的构建及C-Rel／P50／P65转染BHK21细胞对PRV增殖的影响

1 材料与方法

2 结果

3 结论

第三部分 结论

参考文献

致谢

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