斑点叉尾鯝IL-1β基因克隆表达及作为亚单位疫苗佐剂的免疫效果研究

摘要

细胞因子是由机体相关免疫细胞产生的，具有生物调节和多种生物学功能的活性物质。近几十年，国内外学者热衷于鱼类细胞因子重组蛋白作为疫苗佐剂研究，结果显示许多种重组细胞因子蛋白如干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-1β(IL-1β)等，都能不同程度的增加灭活苗、弱毒菌、亚单位疫苗等常规疫苗的免疫效应。它在调节免疫应答反应过程中起重要作用，被公认为新型疫苗的较好免疫佐剂。本研究以斑点叉尾鮰白细胞介素-1β（IL-1β）基因为研究对象，成功克隆并表达了IL-1基因重组蛋白;研究了其作为亚单位疫苗佐剂对斑点叉尾鮰的免疫保护效果。
　　1、斑点叉尾鮰IL-1β基因克隆及原核表达
　　根据GenBank中公布的斑点叉尾鮰IL-1β1和IL-1β2基因序列（GenBank登录号分别为:DQ160229、DQ160230），运用生物学软件设计特异性引物进行PCR扩增，获得的目的片段IL-邛1和IL-1β2分别克隆至pMD19-T载体;经鉴定正确后用BamHⅠ和XhoⅠ将目的片段从克隆质粒上切出，连接到表达载体pET-32a(+)，获得重组质粒pET-32a(+)-IL-1β1/β2。然后，将重组质粒转入BL21(DE3)，进而对重组BL21(DE3)细菌进行诱导温度、时间和IPTG浓度优化;最后在最优条件下大量诱导表达重组蛋白，将纯化的重组蛋白-80℃保存备用;western-blot检测抗体与重组蛋白特异性。结果显示:表达的重组蛋白IL-1β1和IL-1β2均约为48.1Kda，表达的最佳条件为37℃，IPTG浓度0.5mmol/L，诱导时间为4h; western-blot分析结果表明重组蛋白具有较好的特异性。
　　2、重组斑点叉尾鮰IL-1β作为亚单位疫苗佐剂的免疫效果研究将克隆表达出来的重组蛋白IL-1β1和IL-1β2分别与亚单位疫苗pSCPI等体积混合，通过腹腔注射免疫斑点叉尾鮰，分别于免疫后的第1、2、3、4、5、6、7和8周进行尾静脉采血，测定其血清抗体效价、血清杀菌活性、ACH50活性和溶菌酶活性;另外，在免疫第4周进行攻毒试验，记录统计死亡率和免疫保护率。结果显示，重组白细胞介素-1β(IL-1β)作为亚单位疫苗佐剂能够提高斑点叉尾鮰的血清杀菌活性、ACH50活性和溶菌酶活性;同时，血清杀菌活性结果表明血清中起主要杀菌作用的成分是补体和抗体;佐剂疫苗组和无佐剂疫苗组抗体水平均在第4周达到峰值，其中IL-1β1+IL-1β2对提高亚单位疫苗pSCPI的抗体水平效果最明显，而IL-1β1和IL-1β2对亚单位疫苗pSCPI的影响基本上相同;攻毒后PBS、pSCPI、pSCPI+IL-1β1、pSCPI+ IL-1β2和pSCPI+ IL-1β1+ IL-1β2组累计死亡率分别为:93.33％、46.67％、36.67％、33.33％和23.33％。pSCPI、pSCPI+ IL-1β1、pSCPI+ IL-1β2和pSCPI+ IL-1β1+ IL-1β2组相对保护率分别为:50.1％、61.71％、65.29％和75.01％。实时荧光定量PCR结果显示，佐剂免疫组中IL-1β和TNF-α在头肾和脾脏的相对转录水平均高于无佐剂免疫组和PBS组。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．鱼用传统佐剂的研究现状

1．1 油类佐剂

1．2 矿物质类佐剂

1．3 微生物来源佐剂

1．4 动植物来源佐剂

1．5 免疫刺激复合物佐剂

2．鱼类细胞因子佐剂

2．1 细胞因子佐剂的作用机制

2．2 细胞因子类基因佐剂的优越性

2．3 鱼类细胞因子佐剂研究概况

2．4 鱼类白细胞介素-1β(IL-1β)佐剂研究概况

3．选题目的意义

第二章 斑点叉尾鲴IL-1β基因克隆及原核表达

1．实验材料

1．1 试验动物

1．2 主要仪器

1．3 质粒和菌株

1．4 主要试剂

1．5 主要试剂配制

2．实验方法

2．1 斑点叉尾鲴IL-1β基因的扩增

2．2 IL-1β基因的T克隆

2．3 T克隆IL-1β基因的鉴定

2．4 原核表达载体pET-32a(+)-1β1／1β2的构建

2．5．原核表达载体pET-32a(+)-IL-1β1／1β2的表达

2．6 重组蛋白IL-1β1／1β2的制备与纯化

2．7 Western-blot检测重组蛋白特异性

3．结果

3．1 斑点叉尾鲴IL-1β1／β2基因的扩增、T克隆和鉴定

3．2 斑点叉尾鲴IL-1β1／β2基因原核表达载体的构建

3．3 重组质粒pET-32a(+)-IL-1β1／β2诱导表达、条件优化及纯化

3．4 Western-blot检测重组IL-1β1／β2的特异性

4．讨论

第三章 重组斑点叉尾鲴IL-1β作为亚单位疫苗佐剂的免疫效果研究

1．试验材料

1．1 试验菌株

1．2 试验动物

1．3 主要仪器

1．4 主要试剂

1．5 主要试剂和培养基的配制

2．试验方法

2．1 抗原制备

2．2 免疫

2．3 采血

2．4 免疫指标检测

2．5 重组蛋白IL-1β1／2对斑点叉尾鲴细胞因子转录影响

2．6．实时荧光定量(Real-time)PCR分析

2．7 统计学分析

3．结果

3．1 抗体水平检测

3．2 血清杀菌活性检测

3．3 ACH50活性检测

3．4 血清溶菌酶活力检测

3．5 死亡率和相对免疫保护率

3．6 Real-time PCR分析斑点叉尾鲴IL-1β和TNF-α的转录表达变化

4．讨论

参考文献

致谢