胰高血糖素样肽--2对IPEC--J2细胞紧密连接表达与屏障功能的影响及其分子机制研究

摘要

本研究旨在考察胰高血糖素样肽-2(Glucagon-like peptide-2，GLP-2)对脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）应激的仔猪空肠上皮细胞系IPEC-J2细胞紧密连接相关蛋白基因、蛋白表达和屏障功能的影响以及GLP-2调控紧密连接与屏障功能可能的分子机制(PI3K-Akt-mTOR信号转导途径)，深入探讨GLP-2影响肠道屏障功能的基本规律以及可能的作用机理。研究共包括两个试验。
　　试验一、GLP-2对LPS应激的IPEC-J2细胞紧密连接表达及屏障功能的影响
　　本试验在研究LPS与GLP-2对IPEC-J2细胞紧密连接和屏障功能的影响基础上，进一步考察了GLP-2对LPS应激的IPEC-J2细胞紧密连接和屏障功能的影响。
　　试验一采用单因子设计，分别考察100μg/ml LPS、100nmol/L GLP-2和100μg/mlLPS+100nmol/L GLP-2处理IPEC-J2细胞24h，对细胞形态、紧密连接基因、蛋白表达和屏障功能的影响，每个处理4个重复。通过研究GLP-2对LPS应激IPEC-J2细胞紧密连接和屏障功能相关指标的影响，初步探讨GLP-2对LPS应激IPEC-J2细胞的保护作用。研究结果显示:
　　1、与对照组相比，100μg/ml LPS处理可严重破坏细胞形态、显著降低IPEC-J2细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表达(P＜0.01)，降低量分别为46％、57％和34％;可显著降低IPEC-J2细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表达(P＜0.01)，降低量分别为76.5％、81.7％和78.8％;可显著降低IPEC-J2细胞跨上皮细胞电阻(TER)(P＜0.01)，降低量为92.4％。
　　2、与对照组相比，100nmol/L GLP-2处理可有效优化细胞形态、显著增加IPEC-J2细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表达(P＜0.01)，增加量分别为148％、261％和54％;可显著增加IPEC-J2细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表达(P＜0.01)，增加量分别为35％、39％和62％;可显著增加IPEC-J2细胞跨上皮细胞电阻(TER)(P＜0.01)，增加量为27.2％。
　　3、与100μg/ml LPS处理组相比，在100μg/ml LPS基础上添加100nmol/LGLP-2可显著改善细胞形态、增加IPEC-J2细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表达(P＜0.01)，增加量分别为46.3％、65.1％和30.3％;可显著增加IPEC-J2细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表达(P＜0.01)，增加量分别为183％、300％和231.8％;可显著增加IPEC-J2细胞跨上皮细胞电阻(TER)(P＜0.01)，增加量为848.5％。
　　上述结果表明，GLP-2不仅能提高正常IPEC-J2细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA和蛋白的表达，增强屏障功能，还能显著抑制由LPS应激造成的IPEC-J2细胞形态破坏、紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA和蛋白的表达下降，维护细胞屏障功能。
　　试验二、GLP-2调控IPEC-J2细胞紧密连接表达及屏障功能的分子机制研究
　　试验二研究了GLP-2对IPEC-J2细胞紧密连接表达及屏障功能的影响，并通过添加PI3K特异性抑制剂Wortmannin(Wort)和LY294002(LY)进一步探讨了GLP-2能否通过PI3K-Akt-mTOR信号转导途径调控IPEC-J2细胞紧密连接表达及屏障功能。试验共分4个处理，每个处理4个重复，分别为对照组，100nmol/L GLP-2处理组，100nmol/L GLP-2+10nmol/L Wort处理组，100nmol/L GLP-2+10μmol/L LY处理组，其中特异性抑制剂添加组处理前分别用无血清培养液加相应抑制剂培养1h。考察指标包括PI3K-Akt-mTOR信号转导途径中p-Akt和p-mTOR蛋白的表达，IPEC-J2细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA和蛋白的表达，IPEC-J2细胞跨上皮细胞电阻(TER)。研究结果显示:
　　1、与对照组相比，100nmol/LGLP-2处理可显著增加IPEC-J2细胞Akt、mTOR以及紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表达(P＜0.01)，增加量分别为478％、590％、260％、370％和159％;可显著增加IPEC-J2细胞p-Akt、p-mTOR比例以及紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表达(P＜0.01)，增加量分别为59.4％、67.3％，35.0％、38.2％和58.3％;可显著增加IPEC-J2细胞跨上皮细胞电阻(TER)(P＜0.01)，增加量为23.5％。
　　2、与100nmol/LGLP-2处理组相比，100nmol/L GLP-2+10nmol/L Wort处理组可显著降低IPEC-J2细胞Akt、mTOR以及紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表达(P＜0.01)，降低量分别为46.9％、50.5％，38.1％、49.6％和18.9％;可显著降低IPEC-J2细胞p-Akt、p-mTOR比例以及紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表达(P＜0.01)，降低量分别为15.5％、15.4％，10.8％、14.2％和27.6％;可显著降低IPEC-J2细胞跨上皮细胞电阻(TER)(P＜0.01)，降低量为5.4％。
　　3、与100nmol/L GLP-2处理组相比，100nmol/L GLP-2+10μmol/L LY处理组可显著降低IPEC-J2细胞Akt、mTOR以及紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1mRNA的表达(P＜0.01)，降低量分别为67.2％、70.8％，49.6％、60.9％和25.8％;可显著降低IPEC-J2细胞p-Akt、p-mTOR比例以及紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表达(P＜0.01)，降低量分别为24.2％、22.5％，13.7％、16.3％和31.9％;可显著降低IPEC-J2细胞跨上皮细胞电阻(TER)(P＜0.01)，降低量为10.3％。
　　结果表明，PI3K特异性抑制剂Wortmannin(Wort)和LY294002(LY)能够下调PI3K下游相关激酶Akt和mTOR的表达量，能显著抑制GLP-2对IPEC-J2细胞紧密连接表达和屏障功能的提高与增强。
　　综上所述，本研究发现LPS应激显著下调了IPEC-J2细胞紧密连接表达，破坏了IPEC-J2细胞屏障功能，添加GLP-2能够对LPS应激的IPEC-J2细胞产生保护效应。GLP-2可能通过PI3K-Akt-mTOR信号转导途径调控IPEC-J2细胞紧密连接表达及屏障功能。

目录

声明

摘要

本文缩略词表

前言

第一部分 文献综述

1 紧密连接(tight junctions)

1．1 紧密连接的组成

1．2 紧密连接的生物学功能

1．3 PI3K-Akt-mTOR信号转导途径及与紧密连接调节的关系

2 GLP-2的生理功能及其肠营养效应发挥的作用机制

2．1 GLP-2的合成、分泌与代谢

2．2 GLP-2的肠营养效应

2．3 GLP-2发挥生理作用的分子机制研究

3 断奶对仔猪肠道的影响与体外LPS处理断奶仔猪肠细胞应激模型

3．1 断奶对仔猪肠道的影响

3．2 体外LPS处理断奶仔猪肠细胞模型

第二部分 试验研究有待研究的问题及本研究的目的、意义和技术路线

1 有待研究的问题

2 研究的目的和意义

2．1 研究目的

2．2 试验意义

3 技术路线

第三部分 试验研究

试验一 GLP-2对LPS应激的IPEC-J2细胞紧密连接表达及屏障功能的影响

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

试验二 GLP-2调控IPEC-J2细胞紧密连接表达及屏障功能的分子机制研究

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

全文总体讨论

全文结论

有待进一步研究的问题

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文