30种中草药提取物对多子水霉体外抑制作用研究及厚朴抗水霉活性成分初步分析

摘要

水霉（Saprolegnia）是水霉病(Saprolegniasis)的主要病原菌之一。几乎所有淡水水产动物均易感染，对水产养殖业影响巨大。孔雀石绿一度被认为是防治水霉病的特效药，后来发现其随食物链进入人体会造成肝细胞癌变。随着孔雀石绿的禁用，水霉病重新成为危害养殖业健康发展的一大难题。目前养殖生产中常用抗生素、食盐、甲醛等药物预防和治疗水霉病，但均存在防治效果不佳，或不适宜大水面养殖用药等问题。
　　中草药因其来源广、成本低廉、不易产生耐药性等优点为广大科研人员所青睐。目前在水产临床用药上使用中草药治疗水霉病还较少。开展抗水霉中草药的筛选及主要成分的研究不仅有利于解决水霉病有效药物缺乏的临床问题，而且有利于增加我国药物种类储备及降低水产食品安全风险。
　　本研究通过查阅文献从中搜集整理出了三十种可以抑制水霉等真菌的中草药。采用提取、浓缩等技术，通过测定其抗水霉活性，筛选出了对水霉有较好抑制效果的中草药。利用系统溶剂法测定厚朴不同溶剂部位抗水霉活性，并利用不同检测方法对活性最高的提取部位进行了初步分析。
　　1.通过马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养，并经多次纯化后，从感染霉菌的草鱼体表分离到一株致病霉菌CCF1301，制作水浸片，显微镜下观察其形态学表现，进行形态学初步鉴定。同时挑取纯化后的水霉菌丝，提取基因组DNA，利用霉菌鉴定试剂盒扩增其26S rDNAD1/D2基因和ITS基因，送测序公司进一步测序。将获得的序列提交NCBI，利用其Blast工具进行同源性比对，同时利用Mega5.1软件进行发育树分析。结合形态学分析结果对分离株进行综合鉴定。结果发现:本次采集到的丝状真菌菌丝呈管状、透明、无横隔、分支较少、无性生殖过程形成棍棒状孢子囊并产生游动孢子、有性生殖过程产生球形藏卵器，依据真菌鉴定手册对水霉属真菌的描述并结合上述特征将该分离株初步划归为水霉属;利用水霉鉴定试剂盒对分离株26S rDNA D1/D2基因和ITS基因扩增，分别得到一条800bp左右的基因片段，送公司测序后发现26S rDNA D1/D2基因和ITS基因大小分别为839bp和798bp，将该序列提交NCBI，获得序列号分别为KJ577573和KF871196。利用Blast工具检测其同源性发现，两个基因均与水霉属同源性最高，均达到99％以上。同时，利用Mega5.1软件进行发育树构建，发现26S rDNA区序列与GenBank的JN400036序列（Saprolegnia Sp.）类聚为一支，初步判断其隶属于水霉属，ITS区序列进一步鉴定发现其与JN400035序列（Saprolegnia ferax）类聚为一支，判断其为多子水霉（Saprolegnia ferax）。
　　2.将三十种候选中草药粉碎、过筛，用95％乙醇按料液比1∶15，75℃热回流提取1.5h，重复提取三次，合并滤液。粗提液用旋转蒸发仪120r/min，0.09Mpa，75℃挥干溶剂，浓缩成浸膏后，用少量溶剂溶解，制备试验用药液。利用平板法制备不同含药培养基，测定2.0g/L（原生药计）药液浓度对水霉的抑制效果。将具有抑制效果的药物重新挑选，利用微量稀释法测定不同药物对水霉孢子的最小抑菌浓度。结果表明:厚朴、狼毒、五倍子、苦参、丁香这五种药的95％乙醇提取物对水霉具有较好的抑制作用，其最小抑菌浓度分别为2.5×10-1 g/L（原生药计）、2.5×10-1g/L（原生药计）、62.5×10-3g/L（原生药计）、62.5×10-3g/L（原生药计）、0.5g/L（原生药计）;其它二十六种药的95％乙醇提取物对水霉的最小抑菌浓度均≥2.0g/L（原生药计）。由此可以看出，厚朴和狼毒具有较好的抗水霉效果。由于狼毒天然毒性较强，考虑厚朴作为进一步研究的对象。
　　3.利用系统溶剂法，选择石油醚(60～90)、乙酸乙酯、无水乙醇、冰乙酸、水五种溶剂依次提取厚朴不同活性部位，利用旋转蒸发仪浓缩，挥干溶剂并用少量乙醇溶解定容。同时，用微量稀释法测定五个提取部位抗水霉最小抑菌浓度，确定效果最好的最佳提取部位。使用不同方法进一步对抗水霉最佳活性部位可能成分进行初步检识。结果显示:与其他提取部位相比，厚朴石油醚部位具有最强抗水霉活性，对水霉孢子最小抑菌浓度为5.0×10-2 g/L（原生药计），该部位主要成份为脂类、黄酮类、生物碱类、酚类和有机酸等。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 水霉病研究进展

1．1．1 发现史

1．1．2 常见病原种类

1．1．3 易感水产动物

1．1．4 感染症状

1．1．5 侵染机理

1．2 常见的抗水霉药物

1．2．1 化学药

1．2．2 植物药

1．2．3 目前用于临床的抗水霉药物

1．2．4 中草药应用的局限

1．3 选题依据及研究意义

第二章 水霉的分离鉴定

2．1 试验器材

2．1．1 试验仪器

2．1．2 试验材料

2．2 试验方法

2．2．1 水霉培养基制备

2．2．2 水霉分离纯化

2．2．3 水霉形态学鉴定

2．2．4 水霉分子生物学鉴定

2．3 实验结果

2．3．1 水霉的形态学鉴定结果

2．3．2 水霉的分子学鉴定结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 抗水霉中草药的筛选

3．1 试验器材

3．1．1 试验仪器

3．1．2 试验材料

3．2 试验方法

3．2．1 药物选择

3．2．2 待试药液制备

3．2．3 对水霉菌丝的抑制效果测定

3．2．4 对水霉孢子的抑制效果测定

3．3 实验结果

3．3．1 中草药提取结果

3．3．2 对水霉菌丝的抑制效果测定结果

3．3．3 对水霉孢子的抑制效果测定结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 厚朴抗水霉活性部位研究

4．1 试验器材

4．1．1 试验仪器

4．1．2 试验材料

4．2 试验方法

4．2．1 溶剂系统选择

4．2．2 待试药液制备

4．2．3 对水霉孢子的抑制效果测定

4．2．4 药物成份检识反应的选择

4．3 实验结果

4．3．1 不同溶剂提取结果

4．3．2 对水霉孢子的抑制效果测定结果

4．3．2 厚朴石油醚提取物成份初步判断结果

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 结论与创新

5．1 结论

5．2 创新

参考文献

致谢

附录

攻读学位期间发表的学术论文目录