云南腾冲火山地质公园和热海公园根瘤菌遗传多样性的研究

摘要

从云南腾冲热泉公园的豆科植物截叶胡子草、鸡眼草、含羞草决明、波叶山蚂蝗、野大豆、兔尾草、猪屎豆、西南杭子梢、小雀花、茸毛木蓝和腾冲火山口的豆科植物鸡眼草、含羞草决明、波叶山蚂蝗、兔尾草、多花木蓝共分离根瘤菌67株，采用16S rDNA PCR-RFLP、ERIC-PCR、16S rDNA、持家基因(atpD、recA、glnⅡ)、共生基因(nifH、nodC)研究了这些根瘤菌的遗传多样性和系统发育。
　　16S rDNA PCR-RFLP和ERIC-PCR研究结果表明，从云南腾冲采集的豆科植物中分离得到的根瘤菌存在明显的遗传多样性。供试菌株的16S rDNA PCR产物的HaeⅢ酶切有12种图谱类型，HinfⅠ有12种图谱类型，MspⅠ有14种图谱类型，TaqⅠ有9种图谱类型，供试菌株共有18种16S rDNA酶切遗传图谱类型;ERIC-PCR聚类结果在69％相似水平上将供试菌株分成3个表观群:根瘤菌属Rhizobium(19个)、慢生根瘤菌属Bradyrhizobium(44个)、4个菌株单独成群，慢生根瘤菌属于优势种群。
　　根据16S rDNA PCR-RFLP和ERIC-PCR的聚类结果，选取32株代表菌株，采用16S rDNA序列、持家基因(atpD、recA、glnⅡ)序列、共生基因(nifH、nodC)序列对代表菌株进行系统发育的研究。
　　16S rDNA序列分析揭示代表菌株分布在Rhizobium(7个)、Bradyrhizobium(18个)、Herbaspirillum(2个)、Burkholderia（4个）、Labrys(1个)5个系统发育分支中。分离自鸡眼草的根瘤菌全部位于Bradyrhizobium分支上，分离自热泉公园含羞草决明的菌株Q63-2和猪屎豆的菌株Q47-1位于Herbaspirillum分支上，热泉公园的含羞草的菌株Q63-3、波叶山蚂蝗的菌株Q8-2、茸毛木蓝的菌株Q57-3和火山口的多花木蓝的菌株H15-2、兔尾草的菌株H5-1位于Burkholderia分支上，分离自火山口的多花木蓝H17-2位于Labrys。持家基因atpD、recA、glnⅡ的序列分析中，18个Bradyrhizobium属的菌株和4个Rhizobium(Q23-2、H20-3、Q16-1、Q57-1)在属的水平上与16S rDNA一致;一些β-rhizobia的持家基因在PCR扩增中并没有获得其片段，菌株H17-2的持家基因的分析结果表明H17-2位于Bradyrhizobium分枝上不同于16S rDNA序列构建系统发育树。综合16S rDNA和持家基因(atpD、recA、glnⅡ)构建系统发育树:菌株H10-1、H17-2、H8-1、H8-5、H19-2、Q99-1与B.japonicum亲缘关系最近，菌株Q78-3、Q25-1、H23-2、Q94-4、Q2-2、Q1-1的分类地位与B.elkanii亲缘性最近，菌株Q79-3、Q22-4、Q66-3、Q66-6、Q49-3与B.liaoningense亲缘性最近，菌株Q50-4与Q57-1的分类地位与R.leguminosarum亲缘关系最近，H20-3和Q23-2的分类地位与R.tropici亲缘性最近，菌株Q16-1的分类地位与R.tibeticum亲缘关系最近，而菌株Q8-2、Q17-2、Q8-3、Q47-1、Q63-1、Q63-2、Q63-3、Q57-3分类地位并不能确定。共生基因nifH的序列分析中，慢生根瘤菌属菌株的系统发育关系与持家基因和16S rDNA类似，而在Herbaspirillum、Rhizobium、Burkholderia分析中其分类地位与持家基因和16SrDNA不一致，与Entrobacteria属的菌株的亲缘性最近。nodC基因分析中其慢生根瘤菌属系统发育关系与持家基因和16S rDNA类似。

目录

声明

摘要

1．文献综述

1．1 引言

1．2 根瘤菌的分类

1．3 根瘤菌分类中的争议

1．4 根瘤菌分类研究方法

1．4．1 表型多样性研究

1．4．2 遗传多样性研究

1．5 研究目的和意义

2．材料与方法

2．1 样品采集

2．2 根瘤菌分离纯化

2．3 根瘤菌遗传多样性研究

2．3．1 根瘤菌DNA的提取

2．3．2 ERIC-PCR指纹图谱分析

2．3．3 16S rDNA PCR-RFLP分析

2．3．4 代表菌株168 rDNA基因序列分析

2．3．5 持家基因atpD、recA、glnII基因序列分析

2．3．6 共生基因nodC、nifH基因序列分析

2．3．7 系统发育树的构建

3．结果与分析

3．1 根瘤菌分离

3．2 ERIC-PCR

3．3 16S rDNA-RFLP分析

3．4 16S rDNA全序列分析

3．5 持家基因序列分析

3．6 共生基因的序列分析

3．6．1 nifH基因的序列分析

3．6．2 nodC基因的序列分析

3．7 小结

4．讨论

4．1 供试菌株遗传多样性

4．2 环境对遗传多样性的影响

4．3 基因横向转移

5．结论

参考文献

致谢