亚成体大熊猫肠道真菌多样性的初步研究

摘要

大熊猫属我国濒危珍稀动物，其肠道正常菌群是维持大熊猫肠道微生态系平衡的一群微生物，它们与宿主的营养、代谢、免疫及发育等方面紧密相关。因肠道菌群失调造成其微生态失衡而引起一系列肠道疾病是大熊猫致死的主要原因之一。肠道微生物中大部分是细菌，也有一些真菌。目前，对大熊猫肠道微生态的研究大部分见于细菌多样性方面，未见运用分子生物学方法针对其肠道真菌多样性的研究。[目的]分析5只亚成体大熊猫肠道真菌的多样性。[方法]采用基于ITS基因的RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphism)方法，对肠道真菌总DNA进行ITS-RFLP分析，构建ITS克隆文库，然后用HhaⅠ、HaeⅢ进行酶切指纹图谱分析，测序并绘制系统进化树。[结果]研究表明:
　　(1)从转化的平板上随机挑取120个克隆进行分析，CT、YY、YX、ZM、XN分别获得105、113、107、101、106个阳性克隆子，阳性率分别为87.5％、94.2％、89.2％、84.2％、88.3％。用限制性内切酶HhaⅠ和HaeⅢ对阳性克隆子的PCR扩增产物进行酶切，根据酶切片段大小和数量对条带图谱分型，结果表明在CT、YY、YX、ZM、XN的肠道ITS文库中分别分出27、27、18、31、27个OTUs。对其进行多样性分析，构建的文库覆盖率均在80％以上，表明所构建的文库涵盖了亚成体大熊猫肠道的大部分真菌种类;物种丰富度指数(E)均在0.25左右，香农指数(H')均在2.57左右，辛普森指数(D)均在0.11左右，表明亚成体大熊猫肠道真菌的多样性信息比较丰富;Pielou均匀度指数（Jsw）均在0.79左右，表明亚成体大熊猫肠道真菌群落分布的均匀度较好;根据Chaol物种多样性指数(SChaol)预测，亚成体大熊猫肠道大概有23～67类真菌。
　　(2)将CT、YY、YX、ZM、XN文库中属于同一个OUT的克隆随机选一个代表菌进行测序，去除载体序列，将所得序列在GenBank中进行BLAST同源性检索，选取相似度最高的序列。结果显示，5只亚成体大熊猫肠道真菌主要由Ascomycota(平均占46.24％)、Basidiomycota（平均占15.79％）两个门和一些未分类(平均占29.14％)、未培养（平均占8.83％）的真菌。其中，Ascomycota主要以Saccharomycetes（平均占63.74％）和Dothideomycetes（平均占35.91％）两个纲为主;Basidiomycota主要以Tremellomycetes（平均占65.80％）和Microbotryomycetes（平均占33.15％）两个纲为主。而这四个纲分别则主要以Candida、Debaryomyces; Pleosporales、Myriangium; Cystofilobasidium、Trichosporon; Leucosporidium、Leucosporidiella八个菌属为主，各样品中所占比列不等。[结论]亚成体大熊猫肠道内存在一定比例的真菌菌群，且ITS-RFLP技术能够很好的对其多样性进行分析。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 微生物概述

1．1 古菌概述

1．2 细菌概述

1．3 真菌概述

2 大熊猫肠道菌群的概述

2．1 大熊猫肠道菌群研究意义

2．2 大熊猫肠道细菌概述

2．3 大熊猫肠道真菌概述

3 肠道真菌多样性研究方法

3．1 传统培养法

3．2 分子生物学方法

4 本实验研究意义及内容

4．1 研究意义

4．2 研究内容

第二章 实验研究

一 实验材料和方法

1 实验材料

2 熊猫粪便的采集

3 粪便真菌的粗提取

4 提取粪便真菌总DNA

5 粪便总DNA的检测

6 粪便真菌菌群ITS片段的PCR扩增

7 纯化回收真菌ITS扩增片段

8 构建ITS克隆文库

9 RFLP聚类分析

10 对构建的克隆文库进行统计分析

11 DNA序列的测定

12 ITS的系统发育分析

二 实验结果与分析

1 真菌ITS序列的PCR扩增

2 ITS克隆文库分析

3 RFLP分析

4 系统发育分析

三 讨论

1 大熊猫粪便的处理

2 粪便真菌总DNA的提取

3 真菌通用引物的选择

4 限制性内切酶的选择

5 数据的处理及分析

6 ITS-RFLP数据多样性分析

7 测序结果分析

四 结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间待发表的学术论文

附录