鸭瘟病毒UL22基因的多抗制备、细胞内定位及真核表达研究

摘要

本研究对DPV UL22基因进行了分子特性分析、克隆、原核表达、蛋白纯化、多克隆抗体的制备、细胞内的定位及真核表达研究，获如下结果:
　　1.鸭瘟病毒UL22基因的生物信息学分析
　　通过生物信息学分析工具对UL22基因核昔酸序列、编码蛋白gH及与其它疱疹病毒的同源性作了分析。结果表明UL22基因为2505bp，分子量92.5433kDa，编码834个氨基酸，有一条信号肽和两个跨膜区，还含有8个N-糖基化位点和52个潜在的磷酸化位点，抗原位点较多，gH蛋白的分子之间形成了三个二硫键。同源性分析表明gH蛋白在疱疹病毒中是非常保守的，且与马立克病毒属的MeHV-1、GaHV-2和GaHV-3 UL22基因的同源性最高。
　　2.鸭瘟病毒截段基因的原核表达及抗体的制备
　　根据生物信息学预测结果，去除掉gH蛋白的信号肽和跨膜区得到了截段形式的gHt基因，构建了原核表达重组质粒pET32c(+)-gHt，转化到宿主菌BL21后在37℃、0.2mmol/L IPTG及10h诱导条件下，得到gHt蛋白，该蛋白主要存在于包涵体。纯化的gHt蛋白免疫兔子制备的高免血清效价达到1∶32，Western blot证实gHt蛋白可被兔抗DPV血清识别。
　　3.鸭瘟病毒糖蛋白gH的细胞内定位
　　采用间接免疫荧光实验来检测DPV gH蛋白在感染细胞内的表达和定位，实验结果表明gH蛋白主要存在于细胞质中，与生物信息学预测结果一致。gH蛋白在病毒感染6h开始表达，在30-43h表达量达到最大。
　　4.鸭瘟病毒UL22基因真核表达载体的构建及蛋白表达情况
　　对已构建成功的T克隆质粒pMD20T-gH和pMD19T-gHt双酶切，然后与真核表达载体pCMV-HA连接，构建了重组真核表达质粒pCMV-HA-gH和pCMV-HA-gHt。重组质粒经脂质体LipofectamineTM2000转染HEK293细胞，利用RT-PCR、间接免疫荧光试验分析gH和gHt蛋白在HEK293细胞的表达情况，结果表明pCMV-HA-gH和pCMV-HA-gHt在HEK293细胞中的表达量较高，且也同样位于细胞质，这些结果为稳定表达DPV gH蛋白细胞系的构建提供基础。

目录

声明

摘要

缩略词及符号表

一、引言

1 疱疹病毒UL22基因及其编码糖蛋白gH的研究进展

1．1 疱疹病毒的基本特征

1．2 UL22基因序列及其编码蛋白的结构特点

1．3 疱疹病毒糖蛋白gH的功能

1．4 疱疹病毒糖蛋白gH与其它蛋白的相互作用

1．5 展望

2 选题目的及意义

二、实验研究

1 实验材料

1．1 基因序列

1．2 毒株、菌种、载体及细胞

1．3 主要试剂

1．4 主要试剂的配制

1．5 主要仪器

1．6 实验动物

2 实验方法

2．1 DPV UL22基因序列及其编码蛋白的生物信息学分析

2．2 DPV UL22基因的克隆表达、蛋白纯化及多抗制备

2．3 DPV UL22编码蛋白gH在感染DEF中的定位分析

2．4 DPV gH和gHt真核表达载体的构建及表达分析

3 实验结果

3．1 DPV UL22基因序列及其编码蛋白的生物信息学分析结果

3．2 DPV UL22基因的克隆表达、蛋白纯化及多抗制备结果

3．3 DPV UL22编码蛋白gH在感染DEF中的定位分析

3．4 DPV gH和gHt真核表达载体的构建及表达分析

4 分析讨论

4．1 DPV UL22基因序列及其编码蛋白的生物信息学分析

4．2 DPV UL22基因的克隆表达、蛋白纯化及多抗制备

4．3 DPV UL22编码蛋白gH在感染DEF中的定位分析

4．4 DPV gH和gHt真核表达载体的构建及表达分析

三、结论

参考文献

致谢

作者简介及攻读硕士学位期间学术论文发表