几种桉树焦枯病原菌的快速分子检测技术研究

摘要

桉树(Eucalyptus spp.)是桃金娘科(Myrtaceae)桉树属(Eucalyptus)植物的总称，同时是世界著名的用材林树种和速生树种，与杨树、松树并称为林业上的三大速生造林树种。桉树在我国西南、东南、长江中下游等地区的生态环境建设以及解决生物能源问题中发挥着不可替代的作用，具有重要的经济、社会、生态效益。目前在我国西南地区由半知菌亚门的帚梗柱孢属真菌(Cylindrocladium scoparium)引起的桉树焦枯病严重危害着桉树的林业生产建设。由于该病害发病症状极易与其他桉树叶部病害混淆，传统形态学鉴定存在困难，因此建立能够在病害发生早期快速诊断病害的分子生物学诊断方法迫在眉睫。本研究选定不同的靶基因序列，分别建立了基于ITS与factor1-alpha序列桉树焦枯病菌的双重PCR检测体系、巢式PCR体系、环介导等温扩增反应体系（LAMP）三种分子生物学诊断技术，以期为桉树焦枯病的林业生产建设提供有力的技术保障。本研究取得如下结果:
　　1.成功构建了基于ITS与factor1-alpha序列桉树焦枯病菌的双重PCR检测体系。该体系以桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)DNA为模版，分别以ITS和factor1-alpha序列为靶区域，针对Cylindrocladium属和Cylindrocladium scoparium设计了CYS1/CYS2和EF-S-1/EF-A-1两对特异性引物，建立了基于属和种的双重PCR快速检测技术。利用引物BCYS1/CYS2可以将全部Calonectria属的供试菌株扩增出一条351 bp大小的条带，单独用特异性引物EF-S-1/EF-A-1进行PCR扩增仅病原菌扩增出一条197bp大小的条带，同时使用2对引物时，病原菌可扩增出两条明亮条带。当体系退火温度为53℃时，DNA灵敏度检测限度达到450 fg/μL。野外田间时效检测结果显示，该体系能准确检测出不同发病程度桉树组织上的病原菌，完全符合田间检测的要求。
　　2.针对Cylindrocladium scoparium菌株的beta-tubulin gene上保守序列极强的靶基因区域序列进行特异性引物BT-S-1/BT-A-1和通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A的设计和合成，分别利用常规PCR和巢式PCR技术对引物特异性和灵敏度进行检测和比较，同时对所建立的巢式PCR用于桉树焦枯病原菌快速检测的田间时效性进行验证。结果表明，利用beta-tubulin gene序列通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR对全部供试菌株进行扩增，所有参试菌株均可扩增出一条500 bp左右大小的条带;而单独使用特异性引物BT-S-1/BT-A-1进行常规PCR扩增时仅病原菌能够扩增出一条大小为148 bp的明亮条带;当利用通用引物作为第一轮引物，以稀释10倍后的第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，利用特异性引物进行巢式PCR扩增时，也可扩增出上述148bp大小的明亮条带，且巢式PCR的扩增效果较常规PCR具有明显的视觉优越性;灵敏度检测试验表明，巢式PCR的灵敏度可检测到4.5 fg/μL，较常规PCR可以扩增出的极限DNA浓度4.5 pg/μL至少提高了103倍;田间时效检测试验也说明巢式PCR较常规PCR具有更高的准确度和灵敏性，可达到田间检测的要求。
　　3.建立了桉树焦枯病快速有效的LAMP快速检测技术。本试验以桉树焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium为研究对象，利用Primer Explorer V4.0设计软件，针对C.scoparium的beta-tubulin gene特异保守区域设计了一套LAMP特异性引物组（内引物FIP/BIP，外引物F3/B3，环引物LooPF/LooPB），优化并建立了桉树焦枯病原菌的LAMP快速检测体系。研究得到，LAMP反应体系为(50μl):8 U Bst DNAPolymerase1μl;5 M甜菜碱溶液3.0μl;2.5 mM dNTP3.5μl;10×ThermopolⅡ2.5μl;100 mM MgCl2μl;40μM FIP/BIP各1μl;10μM F3/B3各0.5μl;10μMLooPF/LooPB各1μl; DNA模板2μl;用ddH2O补足体积至50μl。反应程序为:65℃水浴锅中反应45 min，90℃下灭活5 min结束反应。特异性检测结果显示，供试的22个样本菌株LAMP产物可以采用肉眼观察、紫外灯照射、添加荧光染料SYBR GreenⅠ、以及电泳检测条带四种不同的形式予以区分。DNA灵敏度检测结果显示，建立的LAMP体系具有较高检测灵敏度，可达到45 pg/μL，完全符合田间检测的要求。野外田间时效检测结果显示，无论是利用紫外检测还是电泳检测均可成功的检测出各地区不同生理小种的桉树焦枯病原菌C.scoparium，且检测效果明显。该LAMP检测是一项能够作为野外基层田间检测的重要技术。
　　总之，本研究针对桉树焦枯病病原菌C.scoparium所建立的三种分子生物学快速检测技术均可有效用于桉树焦枯病害的早期诊断。巢式PCR体系具有高于其他两种检测方法的较高灵敏度，检测极限达到4.5 fg/μL，而普通常规PCR的检测极限仅仅为4.5pg/μL;其次基于ITS与factor1-alpha序列桉树焦枯病菌的双重PCR检测体系，可以检测到的DNA极限浓度相同，达到450 fg/μL，仍然高于LAMP的DNA极限检测浓度。LAMP检测灵敏度虽然较其他二者低，但其可视性观测结果使之成为最具生产潜力的检测手段。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 文献综述

1．1 桉树焦枯病概述

1．1．1 桉树焦枯病的起源和发展

1．1．2 桉树焦枯病的症状及危害

1．1．3 桉树焦枯病的病原研究

1．1．4 病原菌生物学特性研究现状

1．1．5 桉树焦枯病的防治现状

1．2 植物病原真菌的分子检测技术

1．3 几种常见的分子检测技术简介

1．3．1 基于核糖体转录间隔区的常规PCR和巢式PCR技术

1．3．2 环介导等温扩增反应

1．3．3 其他分子检测技术概述

1．4 分子检测技术的应用前景

2 研究目的及意义

3 研究内容及技术路线

3．1 研究内容

3．1．1 基于ITS与factor 1-alpha序列桉树焦枯病菌的双重PCR快速检测体系的建立与田间时效性检测

3．1．2 巢式PCR快速检测方法的建立与田间时效性检测

3．1．3 一种快速检测桉树焦枯病菌(Cylindrocladium scoparium)的LAMP体系的建立与田间时效性检测

3．2 技术路线

4 研究材料与方法

4．1 研究材料

4．1．1 供试菌株

4．1．2 供试培养基

4．1．3 DNA提取试剂及材料

4．1．4 LAMP所需试剂

4．1．5 试验设备

4．2 研究方法

4．2．1 供试菌株的选择及菌丝体的培养

4．2．2 供试菌株DNA提取

4．2．3 DNA质量检测

4．2．4 供试菌ITS区PCR及测序检测

4．2．5 基于ITS与factor 1-alpha序列的双重PCR体系的建立

4．2．6 巢式PCR体系的建立

4．2．7 LAMP体系的建立

5 结果与分析

5．1 供试材料基因组DNA提取结果

5．2 基于ITS与factor 1-alpha序列的双重PCR体系

5．2．1 ITS区引物的特异性

5．2．2 factor 1-alpha(tefl)区引物的特异性

5．2．3 双重PCR引物的特异性

5．2．4 双重PCR灵敏度检测

5．2．5 野外田间时效性检测

5．3 巢式PCR体系分析

5．3．1 通用引物PCR扩增结果

5．3．2 常规PCR特异性引物BT-S-1／BT-A-1扩增结果

5．3．3 巢式PCR扩增反应结果

5．3．4 常规PCR与巢式PCR灵敏度检测

5．3．5 巢式PCR野外时效性检测

5．4 LAMP体系分析

5．4．1 Cylindrocladium属真菌系统发育树的构建

5．4．2 beta-tubulin gene区通用引物PCR扩增结果

5．4．3 LAMP反应体系的建立

5．4．4 特异性反应结果的判断

5．4．5 LAMP反应DNA敏感度

5．4．6 LAMP野外田间时效

6 结论与讨论

6．1 建立桉树焦枯病菌快速分子检测的必要性

6．2 基于ITS与factor 1-alpha序列双重PCR的优越性

6．2 巢式PCR体系的高灵敏性

6．3 LAMP体系的时效性

6．5 结论

参考文献