水黄皮根内生细菌遗传多样性研究及促生菌筛选

摘要

植物体内存在着具有促进植物生长的内生细菌，可用于开发微生物肥料，具有促进植物生长、无污染、低成本等优点。水黄皮是一种生物质能源植物，具有耐高温、耐旱、耐贫瘠、耐盐碱等特性。本研究从采自海南省文昌县红树林的水黄皮(Pongamiapinnata)根中分离内生细菌，应用BOX-PCR和16S rDNA全序列分析等方法对其多样性和系统发育进行了研究。利用Salkowski比色法测定IAA的分泌量、用钼锑抗比色法测定溶解无机磷的能力、采用改进的CAS法测定分泌铁载体的能力、利用Ashby培养基和过硫酸钾氧化法测定自生固氮能力，进而，通过盆栽试验研究了供试细菌的促生能力。研究结果如下:
　　1.从水黄皮根中分离出50株内生细菌，BOXAIR-PCR聚类分析和16S rDNA系统发育分析表明，水黄皮根内生细菌具有丰富的遗传多样性。BOXAIR-PCR聚类分析结果表明，50株内生细菌在82％的相似水平上聚为6个遗传群，其中Ⅰ群包含了58％的菌株;而另外，有7株菌独立成群。
　　2.根据BOXAIR-PCR聚类分析结果，测定了13株代表菌株的16S rDNA序列，构建了供试菌株的系统发育树，表明水黄皮根内生细菌主要分布于芽孢杆菌属(Bacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、棒状杆菌属（Coryneb acte rium）、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)6个属，并揭示了水黄皮根内生细菌具有丰富的遗传多样性，且与已知同源菌属的同源性高(99.2％～100％)。鉴定结果表明，代表菌株G3、G16和G17属于Bacillusaryabhattai，G4和G6属于Bacillus thuringiensis，G9属于Burkholderia anthina，G10和G26属于Ochrobactrum anthropi，G14属于Paenibacillus glycanilyticus，G35属于Corynebacterium callunae，G36属于ysinibacillus fusiformis，G39属于Bacillus subtilis，而G50属于Bacillus cereus。
　　3.通过对代表菌株的生物活性测定，获得了产IAA、溶磷、分泌铁载体和自生固氮的内生细菌。结果表明，13代表菌株均产生IAA(17.55～59.55μg/mL)，以G16产量最高，为59.55μg/mL;有76.9％的代表菌株能分泌铁载体，铁载体浓度为6.00～104.50μg/mL，菌株G26产量最高，为104.50μg/mL; G9具有溶无机磷能力，其溶磷量为4.87μg/mL; G9、G14、G10和G26具有自生固氮能力，固氮量为1.57～6.84μg/mL，以G10固氮能力最强，培养液中全氮量达到6.84μg/mL。对G3、G9和G10进行水黄皮盆栽接种试验，结果表明这3株PGPB能够不同程度地促进水黄皮的生长，其中G10的促生效果最明显，水黄皮植株干重和植株含氮量较对照显著增加。
　　4.筛选获得了5株产铁载体能力强的内生细菌(G3、G9、G10、G17和G26)，其产铁载体的浓度为41.50～104.50μ g/mL;进而，盆栽试验验证了这5株内生细菌对花生的促生效果。结果表明，接种供试菌株促进了花生吸收N、P、K和Fe元素，增加花生植株干重。其中，接种G10和G26，花生干重增加了6.78和23.72％、植株全氮量增加96.94％和76.53％，植株全磷量增加了17.71％和20.83％，植株全钾含量增加了16.15％和14.91％，植株全铁增加了32.14～73.45％。这证明了供试菌株具有良好的促生功能。

目录

声明

论文说明

摘要

1．文献综述

1．1 引言

1．2 植物内生菌研究进展

1．2．1 植物内生菌的概述

1．2．2 内生菌多样性研究

1．2．3 内生菌系统发育研究

1．3 植物内生促生菌研究现状

1．3．1 植物内生促生菌对植物的促生机理

1．3．2 植物内生促生菌的资源开发与利用

1．4 本研究立题依据及主要研究内容

1．4．1 立题依据

1．4．2 研究目的

2．水黄皮根内生细菌遗传多样性研究

2．1 材料与方法

2．1．1 样品采集

2．1．2 供试仪器

2．1．3 供试试剂及培养基

2．1．4 内生细菌分离纯化

2．1．5 DNA提取

2．1．6 BOXA1R-PCR指纹图谱分析

2．1．7 代表菌株16S rRNA基因序列分析

2．1．8 数据分析与处理

2．2 结果分析

2．2．1 供试菌株生长特性及形态

2．2．2 BOXA1R-PCR指纹图谱结果分析

2．2．3 代表菌株16S rDNA序列分析

2．3 讨论

3．水黄皮内生细菌高效促生菌的筛选

3．1 材料与方法

3．1．1 供试菌株

3．1．2 供试仪器

3．1．3 试剂及培养基

3．1．4 水黄皮内生细菌促生活性测定

3．2 结果分析

3．2．1 水黄皮根内生细菌产IAA活性测定结果分析

3．2．2 水黄皮根内生细菌溶磷活性分析

3．2．3 水黄皮根内生细菌固氮活性分析

3．2．4 水黄皮根内生细菌分泌铁载体活性分析

3．3 讨论

4．水黄皮根内生细菌促生效果研究

4．1 水黄皮根内生细菌对水黄皮生长的影响

4．2 产铁载体细菌盆栽试验

4．3 数据处理

4．4 结果分析

4．5 讨论

5．结论及展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

附录